课件：生物分离工程第四章沉淀分离法.ppt

离子强度对盐析过程的影响 盐析沉淀平衡式（Cohn经验公式） S—蛋白质溶解度，mol/L; I—离子强度 c:离子浓度；Z：离子化合价 β，Ks—常数 β和Ks的物理意义 β—截距常数,与盐的种类无关，但与蛋白质的种类、温度和pH值有关。(β= log S0) Ks—盐析常数，与温度、pH值无关，与蛋白质和无机盐的种类有关。 经验方程的图示 在一定的pH值及温度条件下，改变盐的浓度(即离子强度)达到沉淀的目的，称为“Ks” 分级盐析法。 （Ks盐析：固定pH ，温度，改变盐浓度） 2.在一定的离子强度下，改变溶液的pH值及温度，达到沉淀的目的，称为“β”分级盐折法。 （ β盐析：固定离子浓度，改变pH ，温度） 由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，因此常用于提取液的前处理。一般粗提蛋白时常用第1种方法，进一步分离纯化时常用第2种方法。 盐析法分为两种类型 THANK YOU SUCCESS * * 可编辑 4、盐析剂的选择 盐析剂的条件 盐析作用要强： 盐析能力— 阴离子＞阳离子；高价阴离子＞低价阴离子 有较大的溶解度，且溶解度受温度的影响尽可能小。 盐析用盐必须是惰性的，不致影响蛋白质等生物分子的活性，最好不要引入不易分离的杂质。 来源丰富、经济 常用盐析剂—(NH4)2SO4 、Na 2SO4、磷酸盐、柠檬酸盐等。 最常用 (NH4)2SO4 优点：符合上述要求；缺点：水解后溶液pH降低，在高 pH下产氨，腐蚀性强，有异味，有毒，终产物必须除尽。 次常用Na 2SO4 。缺点：在40度以下溶解度较低，因此主要用于热稳定蛋白。 阴阳离子盐析效果 阴离子盐析效果 ： 柠檬酸＞PO43- ＞SO42- ＞ CH3COO-＞ Cl-＞ NO3-＞SCN- 阳离子盐析效果： NH4+ ＞ K+＞Na+ ＞高价阳离子 5、影响盐析的因素 溶质分子种类的影响：Ks和β值 溶质浓度的影响：蛋白质浓度大，盐的用量小，但共沉作用明显，分辨率低； 蛋白质浓度小，盐的用量大，分辨率高； pH值：影响蛋白质表面净电荷的数量，通常调整体系pH值，使其在pI附近； 盐析温度：大多数情况下，高盐浓度下，温度升高，其溶解度反而下降； 6、盐析沉淀法的特点 优点：成本低、无需专门的设备、易于操作、安全性高、不会引起生物物质变性失活、适用范围广； 缺点：通常选择性不好（非蛋白的杂质夹带沉淀很少）， 往往有共沉淀产物，一般作为粗提纯操作，还需要与其它分离方法联合使用。盐份含量高。 （三）有机溶剂沉淀法 定义——在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。 沉淀机理 （1）降低了水溶液的介电常数，使溶质之间的静电引力增加，从而出现聚集现象，导致沉淀。 （2）由于有机溶剂的水合作用，降低了自由水的浓度，降低了亲水溶质表面水化层的厚度，降低了亲水性，导致脱水凝聚。 （3 ）有机溶剂的加入会破坏蛋白质的某种键如氢键，使其空间结构发生某种程度的变化，疏水基团暴露并与有机溶剂疏水基团 结合形成疏水层 有机溶剂中的蛋白质沉淀 有机溶剂沉淀分离的原理示意图 3、有机溶剂的选择 介电常数小，沉淀作用强 对生物分子的变性作用小 与水互溶 安全、无毒、价廉、易回收等 # 常用有机溶剂为：甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇 常用的有机溶剂沉析剂 乙醇（浓度60%） ：沉析作用强，挥发性适中，无毒常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析； 丙酮（浓度40-50%） ：沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广； 特点： 介电常数小， 60%乙醇的介电常数是48 40-50%丙酮的介电常数是22 容易获取 4.有机溶剂沉淀的特点 分辨率高； 溶剂容易分离，并可回收使用； 产品洁净（有机溶剂易祛除）； 容易使蛋白质等生物大分子变性失活； 应注意在低温下操作； 成本高 温度：低温有利于防止溶质变性；有利于提高收率（溶解度下降）；一般在0℃以下，操作时在冰盐浴中进行。 搅拌速度：散热 溶液pH值：通常选在等电点附近 离子强度:离子强度低有利于沉析，盐浓度一般在0.01~0.05mol/L 生物样品浓度: 蛋白质溶液的起始浓度0.5~2%，粘多糖起始浓度1~2%为宜。 稀：溶剂用量大，回收率低，但共沉淀作用小 浓：节省溶剂用量，共沉作用强，分辨率低 金属离子的助沉析作用：Zn2+、Ca2+ 5、有机溶剂沉淀过程的影响因素 （四）等电点沉淀法 定义—调节体系pH值，使两性电解质的溶解度下降，析出的操作称为等电点沉淀。 沉淀机理—蛋白质是两性电解质，当溶液pH值处于等电点时，分子表面净电荷为0，双电层和水化膜结构被破坏