集胞藻PCC6803丁醇胁迫的耐受机制-制药工程专业论文.docxVIP

目 录 第一章 绪论 1 1.1 生物能源丁醇的研究内容 1 1.1.1 丁醇作为生物能源的优点 1 1.1.2 发酵法生产生物能源丁醇的研究 1 1.1.3 合成生物学方法生产生物能源丁醇 2 1.2 有机溶剂丁醇的耐受机理 3 1.2.1 有机溶剂丁醇耐受机理的研究方法 3 基于二代测序技术的转录组学方法 4 基于 GC-MS 的代谢组学方法 4 基因工程方法 6 1.2.2 有机溶剂丁醇的耐受内容 7 1.2.3 有机溶剂丁醇在蓝细菌耐受的研究 8 1.3 本文研究的主要内容 8 第二章 集胞藻 PCC6803 在丁醇胁迫下的转录组学 10 2.1 实验材料与方法 10 2.1.1 实验材料 10 实验对象 10 主要仪器 10 培养基与所用试剂 10 2.1.2 实验方法 12 集胞藻 PCC6803 的正常条件和丁醇处理条件 12 RNA 的制备 12 cDNA 的合成 13 RNA 测序文库的制备 13 文库质检 17 上机测序 17 转录组数据的分析 18 实时定量 RT-PCR 的分析 18 2.2 实验结果与讨论 19 2.2.1 RNA 测序转录组分析的概述 19 2.2.2 实时定量 RT-PCR 的数据分析 23 2.2.3 丁醇耐受相关的潜在的目标基因分析 24 2.3 小结 27 第三章 集胞藻 6803 基于 GC-MS 的代谢组学分析 28 3.1 实验材料与方法 28 3.1.1 实验材料 28 实验仪器与试剂 28 3.1.2 实验方法 29 样品的收集与预处理 29 代谢物的提取 29 样品的衍生化 29 GC-MS 分析 29 数据加工和统计学分析 30 主成分分析 30 3.2 实验结果与讨论 32 3.2.1 丁醇应激反应相关代谢组学的定性分析 32 3.2.2 丁醇应激反应相关代谢组学的主成分分析 33 3.2.3 丁醇应激反应相关代谢组学的定量分析 34 3.3 小结 34 第四章 集胞藻 PCC6803 基因敲除株的构建和分析 35 4.1 实验材料与方法 35 4.1.1 实验材料 35 实验对象 35 实验试剂 35 实验仪器 36 4.1.2 实验方法 37 集胞藻 PCC 6803 全基因组的提取 37 质粒的提取 38 融合 PCR 的原理与方法 38 PCR 产物纯化 39 集胞藻 PCC6803 外源基因的自然转化的方法 40 菌落 PCR 方法验证突变株 40 突变株与野生株生长情况的分析 40 4.2 实验结果与讨论 41 4.2.1 氯霉素抗性片段的获得 41 4.2.2 目标基因上、下游同源臂片段的获得 42 4.2.3 使用融合 PCR 获得基因敲除片段 43 4.2.4 突变株的验证 45 4.2.5 突变株与野生株生长情况的比较 47 4.3 小结 48 第五章 丁醇耐受基因的大肠杆菌过表达系统的构建 49 5.1 实验材料与方法 49 5.1.1 实验材料 49 实验对象 49 实验试剂与仪器 50 5.1.2 实验方法 51 质粒的构建 51 大肠杆菌杆菌转化 52 单酶切反应验证质粒 53 5.2 实验结果与讨论 53 5.2.1 目标基因的电泳图 53 5.2.2 单酶切反应验证的电泳图 54 5.3 小结 55 第六章 结论与展望 56 参考文献 58 发表论文和参加科研情况说明 64 致 谢 65 第一章 第一章 绪论 PAGE PAGE 1 第一章 绪论 1.1 生物能源丁醇的研究内容 1.1.1 丁醇作为生物能源的优点 当今世界能源来源仍然主要依赖于石油燃料。然而，由于石油能源的减少， 原油价格持续升高，以及气体排放所造成日益严重的温室效应， 生物燃料作为 能够替代化石燃料的新能源越来越受到各国政府的高度重视。 乙醇，作为一种传统的生物能源，鉴于其高吸湿性和低能源利用率，并不是 一种理想的生物能源。作为新一代的运输系统生物能源的优良替代物，丁醇具有 很多显著的优点[1, 2]。第一，丁醇可以纯净物或者以任何浓度与汽油相混合的形 式使用。第二，丁醇不管是作为单一能源燃烧还是作为能源燃烧延长剂，都不需 要对目前的汽车发动机进行更改。第三，由于丁醇具有低挥发性、低腐蚀性，所 以丁醇的使用安全性能够得到保障。第四，丁醇不具有吸湿性，这点使得丁醇可 以与汽油混合，利于能源的贮存和分散。第五，丁醇的腐蚀性较低，意味着不会 对汽车内储油器、管道、泵等造成损害。第六，丁醇具有非常高的能源利用率， 这可以提高汽油混合比率。第七，二丁基乙醚的衍生物具有成为柴油燃料的潜力。 因为以上的原因，丁醇的生