黄瓜衰老过程中叶绿素降解相关酶基因cDNA片段的克隆与表达初步分析-蔬菜学专业毕业论文.docxVIP

华中农业大学201 华中农业大学201 l届硕士学位论文：黄瓜衰老过程中叶绿素降解相关酶基因cDNA片段的克隆与表达初步研究 摘要 叶绿素(Chlorophyll，chl)是绿色植物叶绿体内参与光合作用的重要色素，叶绿 素降解是衰老的一个重要现象，叶绿素降解是植物自然生长的结果，也可能受衰老 诱导；植物衰老的一个显著标志是失绿。本文以衰老表现不同的两种黄瓜， ‘华黄5 号’ (Cucumis sativusL．var．Huahuang 5)和西双版纳黄瓜(Cucumis safivus L．var．xishuangbannanesis Qi etYuan)为试材，初步研究了野生种和栽培种衰老过程中 生理生化特性，并且克隆叶绿素降解途径中的两个关键酶基因cDNA片段——脱镁 叶绿素脱镁叶绿酸a水解酶(尸尸日)和脱镁叶绿酸a加氧酶(尉D)。应用Real．time PCR 技术检测其在植株衰老过程中叶和茎中的相对表达量，探讨了PPH和翻D基因的表 达模式及与抗衰老的关系，主要研究结果如下： 1．黄瓜叶片衰老过程中生理生化特性 黄瓜叶片衰老过程中，西双版纳黄瓜和‘华黄5号’黄瓜叶片叶绿素含量总体 表现为先上升后下降。在叶片伸出15天时叶绿素含量最高，叶片伸出35天后，‘华 黄5号’叶片开始出现老化症状，在45天时仅为15天的42％。而西双版纳叶片一 直保持较高叶绿素含量， ‘华黄5号’叶内SOD活性开始快速下降，后有微弱的上 升，在35天后下降，而西双版纳黄瓜在35天时活性最高，后微弱下降，野生种SOD 活性开始出现下降的时间比栽培种晚20天，可能在35天西双版纳黄瓜叶片才开始 衰老。 ‘华黄5号’的POD活性一直呈上升趋势，而西双版纳黄瓜的POD活性变 化呈双峰曲线模式，除在5天时活性低于‘华黄5号’，其余天数远远高于‘华黄5 号’。西双版纳黄瓜和‘华黄5号’叶片POD活性在45天最高，在生长后期，野 生种在清除活性氧方面仍强于栽培种。西双版纳黄瓜叶片中可溶性蛋白含量高于 ‘华黄5号’，西双版纳黄瓜在35天时蛋白含量最高， ‘华黄5号’在45天时含 量最高，并且可溶性蛋白质变化规律不明显。 2．黄瓜茎衰老过程中生理生化特性 黄瓜茎衰老过程中，西双版纳黄瓜茎在45天叶绿素含量最高，和叶片不同，西 双版纳茎中叶绿素含量变化趋势不明显，茎叶绿素含量最高出现在45天，表明野生 种茎可能还未进入衰老期。 ‘华黄5号’茎叶绿素含量在25天最高，茎中叶绿素含 量先上升后下降；野生种茎中叶绿素含量高于栽培种。在栽培种和野生种茎里SOD 活性变化均呈现双峰式变化趋势，西双版纳黄瓜和‘华黄5号’在35天时茎中的 SOD活性最高。西双版纳黄瓜茎的POD活性一直呈上升趋势，‘华黄5号’的POD 变化有呈现双峰趋势。在45天时，西双版纳黄瓜和‘华黄5号’的POD活性达到 摘要最大，并且西双版纳黄瓜茎中的POD活性始终高于‘华黄5号’。在35天时西双 摘要 最大，并且西双版纳黄瓜茎中的POD活性始终高于‘华黄5号’。在35天时西双 版纳和‘华黄5号’黄瓜茎中可溶性蛋白的含量最高，整体变化趋势是先升高后下 降，在45天时最低。表明此时茎已经走向衰老。 3．脱镁叶绿素脱镁叶绿酸a水解酶(PPH)和脱镁叶绿酸a加氧酶酶(jHD) 基因克隆 克隆的纠珥和尉磋因碱基序列片段长度分别为265 bp和230 bp， BLAST核酸 同源性在线分析表明，剧w片段与拟南芥(AT5G13800)、花椰菜(OL386R)、葡 萄(XM002271 131．1)和烟草(AM851012．1)的该家族基因分别具有87％、88％、 80％和78％的核苷酸序列同源性，PAO片段与拟南芥(NM．114357．5)、葡萄 (FJ799360．1)、花椰菜(AB470926)、毛果杨(XM002331446．1)和蓖麻 (XM002523689)的该家族基因分别具有90％、86％、85％、83％和82％的核苷酸序 列同源性，证明该扩增产物是纠啊和朋D酶基因片段。 4．西双版纳和‘华黄5号’黄瓜叶衰老过程中PPH和PAO基因的相对表达量。 即日和PAO基因在西双版纳黄瓜叶中的相对表达量的变化趋势有所不同，PPH 基因的相对表达量是先上升后下降，在35天时表达量最高。PAO基因在15、25天 时表达较弱，在35天时表达最强。即日和PAO基因在‘华黄5号’叶的相对表达 量与在西双版纳黄瓜叶片里表达模式基本相同，PPH基因的相对表达量是先上升后 下降，在35天时表达量最高，PAO基因在15、25天时表达较弱，和在西双版纳不 同的是，PAO基因在45天表达最强。这两个基因在西双版纳和‘华黄5号’叶片中 表达呈正相关。 5．西双版纳和‘华黄5号’黄瓜茎衰老过程中PPH和PAO基因的相对表达量。 与在叶