抗核抗体及抗双链DNA抗体荧光免疫层析法快速筛查试剂盒的研究-临床检验诊断学专业毕业论文.docxVIP

硕士学位论文荧光免疫层析检测法是一种将免疫侧向层析技术、链霉亲和素．生物素放大 系统和荧光检测技术三者结合起来的一种检测技术，该技术首次将荧光蛋白作 为其标记物并结合了链霉亲和素．生物素放大系统，不仅提高了快速检测的稳定 性也提高了试剂检测的灵敏性。同时检测速度快，整个分析过程只需要十五分 钟左右。这种技术是课题组的多项专利技术融合，将它用于抗核抗体的快速筛 查检测试剂盒的研发，可以填补抗核抗体的快速筛查领域中的空白。综上所述，本课题拟采用荧光免疫层析法用荧光免疫分析仪来检测血清标 本中ANA及dsDNA，开发快速检测试剂盒，可用于AID的早期筛查和病情监 控。方法： 1、抗原的制备、纯化、鉴定及固化1．1抗原制备、纯化、鉴定：根据自身免疫性抗原自身特点采取有效的方法(如基因工程合成、质粒提 取DNA等)制备抗原，纯化后利用商品化的单克隆抗体检测试剂盒和确诊为 相关自身免疫疾病且ANA或dsDNA阳性的血清进行验证，以验证制备的抗原 是否合格，然后进一步纯化浓缩，保证靶抗原的丰度与纯度。最后鉴定经过纯 化浓缩处理后的抗原是否符合进一步研究的要求。1．2抗原固化：以PBS缓冲液系统稀释提取抗原至合适浓度，固定于NC膜上：加入待 测不同稀释度的阳性标本，根据荧光强度调整缓冲液成分。对固化过程中的环 境条件，分别在湿度45％、50％、55％和60％进行，以划线粗细均匀，无明显 扩散、无明显疏水斑为佳；在稳定性能上，分别保存1、3、5、7、10天，用 阳性标本检测比较荧光强度。2、荧光蛋白与抗体的结合生物素标记鼠抗人IgG抗体：用PBS溶液将待标记抗体稀释至相应浓度，1II万方数据摘要放入适当的离心管中；DMF将生物素溶解至相应浓度，加入待标记抗体中， 充分反应后，根据反应体系大小，加入一定量的O．1M的NH4CI，终止标记。 4C透析除去多余的生物素和NH4CI，透析好的标记抗体放入．20℃长期保存， 或4℃保存近期实验备用。链霉亲和素标记荧光蛋白：从GeneBank中调取链霉亲和素基因Sa、藻蓝 蛋白B亚基cpcB、裂合酶基因alr0617、藻红胆素合成酶基因hol、pebA和pebB 的序列，设计引物，以藻总DNA作为模板进行PCR扩增获取目的片段转入质 粒，选择同时携带链霉亲和素与蓝藻蛋白cpcB的融合基因，以及Histag标签。通过培养含有质粒的大肠工程菌，进行融合蛋白的表达，鉴定及纯化，获取链 霉亲和素标记荧光蛋白。荧光蛋白与抗体结合能力检测：将生物素标记鼠抗人IgG抗体包被在96 孔板，加入一定浓度的链霉亲和素标记荧光蛋白，通过微孔板检测仪检测荧光 强度检测链霉亲和素标记荧光蛋白与鼠抗人IgG抗体结合能力。3、测试卡的制备及组装 (a)样品垫，以玻璃纤维膜为载体，经样品垫处理液浸泡处理，烘干；(b)荧光蛋白结合垫，以玻璃纤维膜为载体，经结合垫处理液浸泡处理，烘干，将 荧光蛋白经缓冲液稀释后，均匀喷在纤维膜上，烘干：(c)生物素化鼠抗人 IgG抗体结合垫，以玻璃纤维膜为载体，经结合垫处理液浸泡处理，烘干，将 生物素化鼠抗人IgG抗体经缓冲液稀释后，均匀喷在纤维膜上，烘干：(d) NC膜，结合有检测用固相抗原(检测线T)和质控用IgG抗体(质控线C； 本研究dsDNA系统用羊抗兔IgG、ANA系统用羊抗鼠IgG)，分别将抗原和 羊抗兔(鼠)IgG抗体经缓冲液稀释后，用划膜仪均匀划至NC膜上，烘干；(e)吸水垫(f)底板，PS底板，带有不干胶，作为各成分粘贴的载体；上述 (a)。(e)组分按顺序和层叠次序粘贴于PS底板上，切为4mm宽条状，得 到测试条：(g)卡壳：依据测试条的组分分布设计模具，塑料成型制成卡壳；IV万方数据硕士学位论文将测试条装入其中，完成测试卡制各。 4、试剂盒反应条件优化及性能评价通过优化筛选合适的抗原抗体，优化抗原抗体反应浓度、反应时间、缓冲 液体系、加样体积等参数，提高试剂盒准确性、精密度、灵敏度、特异性和稳 定性，并形成稳定的生产工艺。对试剂盒进行性能评价，主要指标为：线性范 围、精密度、灵敏度、特异性和稳定性。通过现有检测方法和研制的快速筛查 测试卡检测结果相比较，评价结果的一致性，评价抗核抗体快速筛查试剂盒的 临床使用效果。结果：1抗ds—DNA抗体检测试剂盒研制开发1．1生物素标记dsDNA抗原(Biotin．dsDNA)的制备：选择pGEM—T载体， pb3433，用LB培养基培养18h集菌后用碱裂解法提取其质粒DNA。使用限制 性核酸内切酶将dsDNA切成具有粘性末端(游离氨基-NH2)的线性dsDNA， 按照5mg／mL生物素酰肼水溶液：5％戊二醛：dsDNA水溶液=5：6：10比例混合搅匀，通过化学交联剂把活化的BSA与具有游离氨基的线性dsDNA连接，形 成dsDNA．BSA包被抗原