铝诱导的酵母细胞程序性死亡及其信号调控研究-遗传学专业毕业论文.docx

浙江大学博士学位论文摘 浙江大学博士学位论文 摘 要 铝(ataminmn,An毒害严重影响着酸性土壤中农作物的产量，因此，Al毒和耐Al机制已 成为植物逆境生物学研究的焦点之一．目前，对有机酸胞外捧Al机制的研究已达到基因调控 的水平，但对胞内耐Al的机制还知之甚少。Al能否诱导植物细胞发生程序性死亡曲ng舢med cell death,PCm，PCD的负调控是否是潜在的耐Al机制，以及Al胁迫与细胞内信号转导之间 有何联系等问题已逐渐引起科学家们的兴趣和关注。本研究以真核模式生物酵母为主要的研 究对象，利用其简单的遗传背景、较短的生长周期、丰富的突变体材料以及进化上的保守性 等优点，为解答上述问题进行了探索。本研究的结果可以概括为几个方面： (1)通过摸索建立酵母实验的简易方法，比如用醋酸锂法将质粒转入酵母细胞，用蜗牛 酶去壁法提取酵母总DNA，用自行设计和制作的玻璃仪器测定酵母生长曲线．发现I-4 mM Al处理可以加快酵母细胞生长，尤以2mMAI最显著。酵母接种后的初始细胞浓度越低，Al 促进细胞生长的效应就越明显。用血球板计数法和流式细胞术证明2 mM Al处理促进酵母细 胞分裂． (2)通过DAPI染色在普通荧光显微镜下观察细胞核的形态，用TUNEL法在激光共聚焦 显微镜下观察DNA链的断裂，利用扫描电镜和透射电镜分别观察酵母细胞的表面和内部特 征、运用流式细胞术测定DNA含量，这些实验结果都证明Al诱导的细胞死亡是PCD的过程。 (3)用RACE方法从早竹的花组织中成功克隆Bax抑制基[圈PpBI-1的3’和5’端eDNA，拼 接后获得推定的eDNA全长序列。在推定的开放阅读框外围设计PCR}I物，仍以RNA逆转录 产物为模板，用高保真酶再次扩增后得到真实的编码序列，用于基因功能研究。 (4)从多方收集各种质粒和酵母菌株。将PpSl-1，动物凋亡抑制基因C缸9和且小2分别 构建于酵母表达载体pGilda或p_Yxll2，转化酵母EGY48或BF264-15Dau。提取转基因酵母总 DNA，用PCR验证阳性克隆。由载体pGilda表达的蛋白产物中具有融合抗原LexA，因此使 用∞6．IaA通用抗体检验凋亡抑制蛋白是否正确表达。构建含融合片13[PpBI-1．．GFP的两个 酵母表达载体，在激光共聚焦显微镜下观察到LcxA-PpBI-I-GFP主要定位于细胞核周边区 域。测定酵母在液体或固体培养基上的生长率、存活率、PI膜通透率等指标，表明凋亡抑制 基因Ced-9、Bcl-2：gIPpBI-I具有一定的耐Al功能，其中Bcl-2可能发挥了抑制酵母细胞分裂和 细胞死亡的双功能。 (5)发现凋亡抑制基因可以显著延长酵母细胞冷冻保存的时间，并增强恢复生长的能 力。因此，对酵母冷胁迫诱导的凋亡进行了初步研究，观察到明显的染色质环化现象。另外 浙江大学博士学位论文还发现，酵母谷胱甘肽(G跚合成酶的缺陷造成对冷胁迫的敏感，)／i]PpaI．1耐冷的效果可能 浙江大学博士学位论文 还发现，酵母谷胱甘肽(G跚合成酶的缺陷造成对冷胁迫的敏感，)／i]PpaI．1耐冷的效果可能 与GSH的协同作用有关． (6)用特异的荧光染料结合流式细胞术，发现凋亡抑制基因cb小9，Bcl-2和PpBI-I不能 抑制Al诱导的活性氧自由基(reactiveoxygen叩∞确，ROS)水平增加，却可以直接调节胞内钙 离子(ca2+)水平．这个结果暗示，凋亡抑制基因是作用于Al诱导的ROS卜．游途径或不依赖于 ROS的另一条途径中，很可能调控钙信号的转导通路。在酵母突变体钙敏感性测试的基础上， 筛选出对Al胁迫敏感的酵母液泡Ca2+／ATPase(Pmcl)突变株K605，为后续研究提供了新的切 入点．为了捧除非特异性，做了一系列其它胁迫处理的对照实验，结果表明突变株K605对 AI“，H202和Ca2+显著敏感，对山梨醇或甘露醇高渗处理以及铜离子(cu2+)或镉离子(cd2+) 等胁迫均不敏感． (7)构建植物表达载体pCAMBIA-1301 1-PpBI-I和pERS-PpBI-I，将pERS-PpBI-1转化拟 南芥当代盯o)，获得转基因小苗盯1)，收取种子fr2)保存．统计T2代的种子fr3)在潮霉素培 养基上的分离比，从而确定T2代的1-3，2-1、2-2希t3-9为纯合母本．然后，提取基因组DNA， 检验转基因PpBI-1是否已经整合，结果只有1号和2号株系是转基因Hl性，因此选择PCR阳性 的1．3和2-2的后代口3)以及1．3-4和2．2-5的后代(T4)做进一步分析。RT-PCR的结果是，1．3．4 的后代fr4)不用雌二醇诱导也能表达，且表达量较高；2-2-5后代fr4)j}j雌二醇诱导才能表达， 且表达量较低。 在上述工作的基础上，我