毛细管电泳核酸定量分析及基因突变检测方法研究-应用化学专业毕业论文.docx

上海交通人学博I‘论文 上海交通人学博I‘论文 摘要 R2：0．996，批内和批间相对标准偏差分别为7．3％和14．92％。我们还同时用 三种方法(real．timePCR，CZEt,C7_,E2)对50个正常人的血清样品进行测定，结果 表明毛细管区带电泳和实时定量PCR两种方法的相关性非常好，而且进一步证 明血样的采集等处理步骤对循环血DNA水平有重要的影响。 (3)基于逆流衍生基因突变检测方法研究。我们将逆流衍生标记法成功地用 于恒变性剂毛细管电泳咀及单链构象多态性分析两种基因突变检测方法中。我们 分别用SYBR Gold和EvaGreen两种染料为DNA荧光内插试剂，对MTHFR基 因的C677T进行了突变检测。系统地研究了实验条件对突变检测的影响，选择 4M的尿素和20％的甲酰胺作为变性剂，6％的线性丙烯酰胺作为筛分介质。在恒 变性剂毛细管电泳突变检测中，应用两种染料均得到很好的结果，对于杂合子样 品得N-f两条同源双链DNA以及两条异源双链DNA的峰。同时采用柱上衍生 法进行实验，发现对于杂合子样品得到分离度非常差、荧光信号比较弱的四个峰， 更有趣地是在温度达到54 oc以上时，荧光信号非常弱，不能被检测器检测到。 荧光标记引物是基因突变检测中应用最广泛的一种标记方式，因此我们同时用荧 光标记引物的方法作了对照实验：在单链构象多态性分析中，对于杂合予样品我 们得到了四条单链DNA的四个峰。纯合子样品得到两条单链的两个峰，实验还 进一步证明EvaGreen这种新型荧光染料还可以应用于单链DNA的分析。我们 的结果初步表明逆流衍生的柱后标记方式可以成功地用于恒变性剂毛细管电泳 以及单链构象多态性分析方法的基因突变检测。 (4)基于MutS蛋白分子识别基因突变检测方法研究。MutS蛋白是DNA错 配修复系统的重要组成部分，MutS蛋白能够识别并结合八种错配DNA双链， 以及由碱基修饰引起的错配，还能识别结合1-4个核苷酸插入或缺失形成的loop 环结构。多种基于MutS蛋白分子识别基因突变／多态性的检测技术，相对比较复 杂，而且成本比较高。为此我们偿试用毛细管电泳．激光诱导荧光的系统对基于 MutS分子识别基因突变及多态性进行初步探索。实验中我们选择O．5％的PVP 作为筛分介质，成功地发现MutS蛋白对错配DNA双链有较强的结合能力，同 时还发现对完全匹配DNA双链仍有轻微的非特异性吸附。我们的结果表明毛细 管电泳与MutS蛋白分子识别技术结合可能成为基因突变检测新方法。 关键词：毛细管电泳； 内插染料；循环血DNA；逆流衍生；基因突 变；MutS 上海交通大学博上论文 上海交通大学博上论文 Abstrad Abstract High performance capillary electrophoresis is a new analytical technique developed in the first 1980s．This technique is characterized by the high resolution， short analysis time，small sample requirement，high sensitivity and automation． Therefore it is widely used in many fields，such as chemistry,bio—technique，clinical medicine and pharmaceutics etc．Hiigh performance capillary electrophoresis has become a more powerful method especially in nucleic acid，for instance the analysis of PCR products and restriction digest fragments，mutation detection，genotyping and DNA sequencing． Laser-induced fluorescence detection is one of the most sensitive method． Capillary electrophoresis(cE)coupled with laser-induced fluorescence(LIF) detection becomes an ana