抗菌肽基因的改造及其植物表达载体的构建-生物化学及分子生物学专业毕业论文.docxVIP

摘要阳离子抗菌肽是一类广泛存在于昆虫、动物、植物体内的小分子抗菌活性多肽， 摘要 阳离子抗菌肽是一类广泛存在于昆虫、动物、植物体内的小分子抗菌活性多肽， 蚨体可分为：杀菌肽(Cecropin)、蛙皮素(Magainin)、蜂毒素(Melittin)、防御素(Defensin) 等四大类J eEMA为人工合成的阳离子抗菌肽，由cecropin A的N．末端8个氨基酸残 基和经改造的蜂毒素c．末端组成，既保持了很强的抑菌活性，又降低了溶血毒性。由 于其抗菌谱广、杀菌力强等优点，在植物抗病基因工程中有广阔的应用前景，但由于 对植物细胞有毒害作用，CEMA在植物遗传转化中的应用受到很大的限制。如果能对 CEMA进行改造，在不影响强抑菌力的前提下，尽量减少对植物细胞的毒害作用，将 极大地推进其在植物抗病基因工程中的应用。本文通过在CEMA的N端添加信号肽， 对其进行改造，以探索不降低抑菌作用的同时，降低其对植物细胞毒害作用的可能性。 植物防御素，是另一类阳离子抗菌多肽。与CEMA直接同病源菌的细胞膜发生作 用不同，植物防御素被认为是通过真菌菌丝细胞膜上的特异受体发挥抑菌作用的。由 于对真菌，特别是丝状真菌有很强的抑制作用，而对植物细胞没有毒害作用，防御素 有望在植物抗病基因工程中得到广泛应用。 ／主要工作和结果如下： -1．带信号肽CEMA基因的PCR合成 以两条部分重叠长链引物P：和B延伸产物为模板，P，和P4为正、反引物进行PCR 扩增，获得了改造的抗菌肽基因SPCEMA(187bp)。经pUCl21等中间载体的亚克隆， 构建了pESPCEMA植物表达载体。 2．MCEMA和植物防御素基因的PCR合成 以经测序验证的SPCEMA为模板，用E和P4扩增得到了全长141bp的MCEMA， 并构建了植物表达载体pEMCEMA。 通过合成六条长链引物，经两次PCR扩增，获得了238tl,的植物防御素AFP基因 全长，并构建了植物表达载体pEAFP。 3．构建了双价抗菌肽基因植物表达载体pEASP 鉴于植物防御素与CEMA的空间结构、作用机制有所不同，两者在植物中的同时 表达，有可能对病源真菌有协同抑制作用，构建了双价植物表达载体pEASP。 以上三个单价和一个双价抗菌肽表达载体在植物中的遗传转化，有望获得对病源 真菌有广谱抗性的转基因植株e尹—7一、 关键词：抗菌肽：杀菌肽：防御素：PCR：长链互补引物 Modification Modification of antimicrobial peptide genes and the construction of plant expression vectors harboring theses genes Candidate：Niu Guoqing Advisor：Pro．Peiyan (Biotechnology Research Center，Southwest Agricultural University,Chongqing，400716，China) Abstract Cationic antibacterial peptides are found in insect，animal and plant．They are grouped into four classes including cecropins，magainins，meliains and defensins．CEMA consists of eight amino acid from N-terminus of cecropin A and C·terminus of modified melittin．It maintains potent antibacterial activity and deprives of the hemolytic activity．With its broad— spectmm and non-specific potent antibacterial activity，cationic antibacterial peptide has the potential to be widely used in plant disease resistance genetic engineering．However,CEMA was refrained in plant genetic engineering application due to its toxic to plant cells．The modification of CEMA will facilitate its wide application．In this paper,signal peptide