植物抗污染分化进化研究进展及其分子生物学技术的应用.docVIP

植物抗污染分化进化研宄进展及其分子生物学技术的应用 长期以来人们凭借形态特征和数量变化来进行植物抗 污染生态分化研究，但对许多深入的研宄却无能为力。目 前，分子生物学技术日趋成熟并己大量运用于污染进化生 态学研究中。这些技术的引入为传统分化进化研究打开了 新局面，为进一步从本质上揭示污染条件下植物进化提供 了可能。只有将分子生物学技术引入植物抗性进化研宄中， 将宏观与微观结合起来我们才有可能使许多问题得以解决 [19]。同工酶、等位酶电泳技术的完善，作为第一代分子 生物学标记的R FLP技术，以及近年来PCR技术的成熟和 RAPD技术在国内外迅速发展，为实现上述研究提供了迅捷 可靠的工具。 同工酶电泳技术 同工酶作为基因产物的蛋白质，其结构的多样性在一 定程度上反映出不同种群在不同污染历史条件下分化进化 上DNA组成和生物体遗传多样性。同工酶之所以作为分化 进化的重要研宄对象，首先是因为它在品种间有丰富的多 样性。目前一半以上的酶类存在同工酶类。其次，同工酶 易于检测出。同工酶虽然由单拷贝基因编码，但通过酶染 色放大作用同样易于检测出。 等位酶作为一种特殊形式的同工酶，它由一个基因位 点、不同等位基因编码。根据等位酶谱带的遗传分析确定 出每种等位基因在居群中的频率，从而计算出它们的遗传 相似度或遗传距离，再根据遗传距离分析植物对污染的适 应过程中遗传结构变化，依据分子钟进化理论计算出遗传 进化的理论时间，从而评估污染对植物进化影响的速度和 强度［8、14］。目前的研究结果表明，经历污染时间越长， 居群间的遗传相似系数就越小［5, 14，21］ Mejn artowicz［2 4］利用同工酶技术发现受氟化物、 S02污染的苏格兰松F1代某些基因和基因型大为减少， Muller-S tarck等［22］利用同工酶技术研究表明欧洲山毛 榉同工酶平均每个位点基因数目随污染而下降，Scho lz等 ［23］检测了挪威云杉对S02敏感性各不相同的一系列无性 系的若干同工酶位点，也证明一定量的遗传信息有因污染 而丧失的危险性［20-22］。但是，由于种群杂合性影响，某 些同工酶分析显示了相互矛盾的结果，这表明同工酶技术 所揭示的与污染胁迫的植物遗传变异的复杂性［3、15、21、 2 5］。 RFLP技术 RFLP（Rest rictionFra gmentLengt hPolymorph isma, 限制性内切酶片段长度多态性）作为第一代分子生物学标记 自问世以来已广泛运用于多门生物学科研究中，但它运用 于植物抗性研究还只是近几年的事。RFLP能对植物的抗性 基因进行定位和分离，利用RFLP技术，对于核基因组或叶 绿体基因组、尤其是后者，若能提取纯净DN A，则可直接 从酶切后的电泳图谱看出其多态性，利用这一方法可以测 定种群内、种群间不同水平的物种在污染环境下抗性分化 进化水平上的差异。 与核酸序列分析相比，RFL P可省去序列分析中许多非 常繁琐工序，但相对RAPD而言，RF LP方法更费时、费力， 需要进行DNA多种酶切、转膜以及探针的制备等多个步骤， 仅对基因组单拷贝序列进行鉴定。但RFLP又有比RAPD优 越之处，它可以用来测定多态性是由父本还是母本产生的， 也可用来测定由多态性产生的突变类型究竟是由碱基突变 或倒位、还是由缺失、插入造成的［26］。 PCR技术 PCR（Pl oymeraseCh ainReactio ns,聚合酶链式反应）自 80年代中期问世以来，以其快速、简便、灵敏、特异等特 点受到分子生物学界极大青睐，已广泛用于基因工程、临 床检验、环境生物监测以及进化生态学中核酸水平的基因 多态性等研宄领域。 P CR由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸三部 反应构成一个扩增循环，使目的DNA片段得以迅速扩增。 这一技术能选择性富集一个特异DNA序列，并成106扩增。 PCR扩增技术与RFLP结合使用其用途更为广泛，PCR技术 主要优点有：①PCR与DNA测序结合，扩增后无需再克隆， 纯化即可直接测序。②可扩增一个只知基因一侧或两侧碱 基序列的基因。③可进行DNA多种突变的测定，如碱基互换、 缺失、插入型突变［16］。PCR近几年已逐渐引入到植物抗污 染进化研究领域中，并表现出强大的应用潜力。 RAP D技术 1990年Williams和W elsh等［27、2 8］运用随机扩增 寻找多态性DNA片段作为分子标记，并将此法命名为RAPD 法（Ra ndomAmplif iedPolymor phismDNA，随机扩增多态性 DNA）。尽管RAPD技术诞生时间不长，但由于其独到的DNA 多态性及快速和比PCR更简便等特点，使它成为基因组遗 传图谱构建；基因定位及进化生态学研究中最为重要手段 之一。 RAPD与PCR、