抗转化生长因子β1核酶对肝星状细胞生物学活性影响的实验研究-内科学(消化系病)专业毕业论文.docxVIP

博士学位论文华中科技大学问济医学院 博士学位论文 华中科技大学问济医学院 抗转化生长因子 ? 1 核酶对肝星状细胞 生物学活性影响的实验研究 摘要 一、抗 TGF .? 1 锤头状核酶对活化型肝星状细胞生物学活性的影响 『目的j 抗 TGF? 1 锤头状核酶的胞外、胞内活性鉴定以及对活化型肝星状细胞生 物学活性的影响 『方法j 制备同位素标记的核酶与靶 RNA ，然后在不同条件下进行切割反应来鉴 定核酶的胞外活性。把核酶及其失活核酶的真核表达载体转染入 HSC-T6 细胞内， 筛选稳定细胞克隆，通过分析核酶和靶基因的表达鉴定核酶的胞内活性。检测 HSC-T6 细胞的增殖、胶原沉积和活化来评价核酶对活化型肝星状细胞生物学活性 的影响。 『结果l抗 TGF ? 1 核酶在胞外具有高效特异的切割活性，在转染的细胞内可以下 调靶基因的表达，抑制 HSC-T6 的增殖、胶原的沉积，但是对于 HSC-T6 的活化没 有抑制作用。 f 结论j 抗 TGF? 1 锤头状核酶通过抑制靶基因以及下游基因的表达逆转活化型 HSC 的生物学特征，因此为肝纤维化的基因治疗提供新的思路。 二、抗 TGF ? 1 Ul snRNA 嵌合型核酶对活化型肝星状细胞生物学活性的 影响 『目的1 评价抗 TGF ? 1 Ul snRNA 嵌合型被酶对活化型肝星状细胞活化、增殖以 及胶原沉积的作用 f 方法l将针对 TGF ? 1 的锤头状核酶克隆入 U1 snRNA 的表达框内，鉴定嵌合型 核酶的胞外活性。把嵌合型孩酶及其失活核酶的表达载体转入 HSC-T6 细胞内，通 过分析嵌合型核酶、靶基因的 表达以及 HSC-T6 的增殖、胶原沉积及活化来评价其 对于 HSC 生物学活性的影响。 f 结果J UI Rz445 和 UI Rz803 在胞外具有特异切割靶 RNA 的活性，在转染的细 华中科技大学问济医学院博士学位论文 华中科技大学问济医学院 博士学位论文 胞中可以高效表达，且有效下调 TGF 们的表达而且有效抑制 HSC-T6 的增殖， 胶原的沉积，但是对于 αSMA 和肌丝蛋白的表达无明显影响。 f 结论j 抗 TGF ? 1 Ul snRNA 嵌合型核酶有望成为抑制肝纤维化有效的核酸药物， 从而为肝纤维化的基因治疗提供一种新的方法。 三、发夹状核酶 Gu 突变对胞外切割活性的影响 『目的 j 研究发夹状核酶结构中 Gl1特定核昔酸对于其胞外切割活性的影响 『方法j 用 32p 标记长度为 267 nt 含有乙型肝炎病毒 C 区 pKC 的胞外转录物作为 靶 RNA; 把合成的 GIl位突变的发夹状核酶基因片段克隆入自剪切核酶载体 p 1.5 内，构建发夹状核酶的胞外转录载体 pHpRz;用 32p 标记 pHpRz的胞外转录物， 变性 PAGE 电泳进行核酶的鉴定和纯化。把未标记的各种核酶与同位素标记的靶 RNA 在不同条件下进行切害。反应，变性 PAGE 电泳，放射自显影分析反应结果。 『结果 1 切割结果显示，与底物的靶序列完全互补的发夹状核酶具有最高的切割 活性，随着与靶序列的互补能力降低发夹状核酶的切割活性逐渐下降，以至消失。 『结论j 发夹状核酶结构中的 G1l位点对于其切割活性不是必需的，所以与发夹状 核酶的 Gll 位点相对应的靶序列的选择不受此位点的限制。 『关键词j 转化生长因子 ? 1; 锤头状核酶; Ul snRNA; 嵌合型核酶:基因治 疗: 肝星状细胞:肝纤维化:发夹状核酶:点突变;酶反应动力学 2 华中科技大学问济医学院博士学位论文 华中科技大学问济医学院 博士学位论文 Effect of ribozymes against transforming growth factor 。1on biological character of activated HSCs ABSTRACT Part 1 Effect of bammerhead ribozymes against transforming growtb factor ? 1 on biological cbaracter of activated HSCs Aims! To ìnvestígate ;n vitro cleavage activity二 intracel1ular activity of hammerhead ribozymes against TGF ? 1 and the e佳运ct of the ribozymes on biological character of activated HSCs. Metbods: In vitro cleavage activities of ribozymes agaìns