黄芪总苷对糖皮质激素和β 淀粉样蛋白协同诱导神经元损伤的保护作用及其机制研究-药理学专业毕业论文.docx

安徽医科大学博士学位论文 安徽医科大学博士学位论文 5 5 抗衰老和神经保护作用。临床常用于防治心脑血管疾病、促智、延缓衰老、免疫 功能紊乱性疾病和抗肿瘤等多种疾病。本课题在前期研究的基础上，进一步研究 糖皮质激素和Aβ对神经元的损伤作用及在AD发病中的作用，同时研究黄芪总苷对 糖皮质激素和Aβ诱导神经元损伤的保护作用及其机制。 方法与结果 第一部分 黄芪总苷对糖皮质激素诱导小鼠学习记忆损伤的保护作用及其机制 本实验采用地塞米松（DEX, 5mg/kg，ig 21d）诱导12月龄小鼠学习记忆障碍 和神经元损伤，用自主活动仪测定造模后第10天和第20天小鼠的自主活动；采用 Morris水迷宫观察小鼠的学习记忆功能；采用HE染色观察小鼠脑组织病理形态学 变化；采用Hoechst 33258染色荧光显微镜观察脑组织皮层和海马CA1、CA3区神经 元凋亡；采用RT-PCR检测小鼠脑组织中β淀粉样前体蛋白（APP）、α-分泌酶、β- 分泌酶，Caspase-3 mRNA的表达水平；采用免疫组化检测小鼠脑组织APP、细胞 色素c和Caspase-3的表达水平；采用Ac-DEVD-pNA和Ac-LEHD-pNA裂解法测定小 鼠脑组织Caspase-3和Caspase-9的活性。 实验结果显示，DEX能减少小鼠自主活动，AST40mg/kg组在造模后第10天能 增加小鼠的自主活动；水迷宫结果显示，DEX能减少小鼠在平台象限游泳时间和 穿过平台次数，人参皂苷Rg1和AST20、40mg/kg能增加小鼠在平台象限的游泳时 间，人参皂苷Rg1和40mg/kg能增加小鼠穿过平台的次数。HE染色和Hoechst 33258 染色结果显示，DEX能导致脑组织海马CA1、CA3区和皮层神经元损伤和凋亡， AST对神经元的损伤和凋亡有一定的改善作用。RT-PCR分析显示，DEX能增加 APP695、APP751，β-分泌酶和Caspase-3 mRNA的表达减少α-分泌酶mRNA表达。AST (20，40 mg·kg- 1 )和人参皂苷Rg1可降低DEX诱导升高的APP695、APP751，β-分泌酶 和Caspase-3 mRNA水平，升高α-分泌酶mRNA水平。免疫组化结果显示，DEX可 增加小鼠脑组织皮层和海马CA1、CA3区APP、细胞色素c和Caspase-3表达，AST 6 6 和Rg1能不同程度减少APP、细胞色素c和Caspase-3表达量。DEX能升高小鼠脑组 织caspase-3、caspase-9活性， AST20、40mg/kg组小鼠脑组织caspase-3、caspase-9 的活性有一定的降低作用。 第二部分 黄芪总苷对糖皮质激素和 Aβ协同诱导大鼠 学习记忆损伤的保护作用及其机制研究 本实验采用Aβ25-35双侧海马CAl区注射同时灌胃地塞米松（DEX）14天建立大 鼠学习记忆损伤模型，采用Morr i s水迷宫检测大鼠学习记忆功能；采用HE染色观 察大鼠脑组织海马CA1区病理形态学变化；采用Hoechst 33258染色荧光显微镜观察 脑组织海马CA1区神经元凋亡；采用电镜观察大鼠脑组织海马神经元超微结构；采 用RT-PCR检测大鼠脑组织中β淀粉样前体蛋白（APP）、α-分泌酶、β-分泌酶， Caspase-3 mRNA的表达水平；采用免疫组化检测大鼠脑组织海马CA1区APP、 Aβ1-40、细胞色素c和Caspase-3的表达水平；采用western blot检测大鼠海马组织APP 蛋白表达水平；采用ELISA试剂盒检测大鼠海马组织Aβ1-40含量。 实验结果显示， DEX和Aβ协同作用能延长大鼠水迷宫第4天平均逃避潜伏期， 减少平台象限游泳时间和穿过平台次数明显，人参皂苷Rg1组和AST20、40mg/kg 组能增加小鼠在平台象限的游泳时间和穿过平台的次数。HE染色和Hoechst 33258 染色结果显示，DEX和Aβ协同作用能导致大鼠脑组织海马CA1区神经元损伤和凋 亡，AST对神经元的损伤具有一定的保护作用。电镜检查结果显示，DEX和Aβ协 同作用大鼠脑组织海马神经元染色质有边集现象，胞浆内有大量的空泡形成，线 粒体肿胀明显，脊消失，核糖体数量明显减少。人参皂苷Rg1和AST20、40mg/kg 对大鼠脑组织海马神经元超微结构有一定改善作用，染色质边集现象较少，线粒 体肿胀减轻，核糖体数目增加。RT-PCR分析显示，DEX和Aβ协同作用能增加 APP695、APP751，β-分泌酶和Caspase-3 mRNA的表达，减少α-分泌酶mRNA表达。 AST (20，40 mg·kg- 1 )和人参皂苷Rg1对DEX和Aβ诱导升高的APP695、APP751，β- PAGE PAGE 7 分泌酶和Casp