氯碘喹啉对细胞金属离子稳态的调控作用研究-生物化学与分子生物学专业毕业论文.docxVIP

氯碘喹啉对 氯碘喹啉对细胞金属离子稳态的调控作用研究 万方数据 万方数据 东华大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允 许论文被查阅或借阅。本人授权东华大学可以将本学位论文的全部或 部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存和汇编本学位论文。 保密□，在 年解密后适用本版权书。 本学位论文属于 日期： 2016 年 1 月 14 日 日期：2016 年1月14日 III 王连秋硕士学位论文答辩委员会成员名单 姓名 职称 职务 工作单位 备注 李震 研究员 答辩委员会主席 上海农科院 李凯 副研究员 答辩委员会委员 东华大学 周宇荀 副研究员 答辩委员会委员 东华大学 孟清 教授 答辩委员会委员 东华大学 杨光 副教授 答辩委员会委员 东华大学 杨雪霞 副教授 答辩委员会委员 东华大学 周兴平 研究员 答辩委员会委员 东华大学 林瑛 副教授 答辩委员会秘书 东华大学 IV 氯碘喹啉对细胞金属离子稳态的调控作用研究 摘要 矿质元素是生物体生存所必需的重要基础物质之一，构成细胞组织成分，调 节生理功能发挥重要作用。然而人体内必需金属离子失衡或坏境有毒金属离子的 侵入将导致多种疾病的发生，如心血管疾病、神经退行性疾病等。氯碘喹啉 (Clioquinol，CQ)，最早用于治疗疟疾，但因产生一些副作用，如视网膜病变、 心脏病等，被某些地区禁止使用。近来研究发现该药具有降低金属离子在中枢系 统的富集，对神经退行性疾病有一定的治疗作用，重新引起了人们的重视，但其 中的分子机制并不清楚。本文利用金属组的研究方法以及模式生物酵母 (S. cerevisiae)研究了 CQ 对胞内金属离子内稳态调控的分子机制。 首先，通过 ICP-AES 方法检测了 CQ 对小鼠不同组织内 Zn2+、Fe3+、Cu2+、K+、 Mg2+和 Ca2+含量的影响，数据显示 Zn2+和 Fe3+含量降低，而 Ca2+含量升高。酵母中 亦如此。其中钙离子参与神经递质的合成与释放，在细胞信号转导中也有重要 生物学意义，所以深入研究了 CQ 对胞内钙离子的调节机制。利用 pmc1△、 vcx1△、pmr1△、cch1△多种钙离子转运缺陷菌株的药物敏感分析及离子检测 分析，发现 CQ 处理，抑制细胞 Zn2+、Fe3+吸收，但不同于 EDTA 的作用,促进了 Ca2+富集，并与处理浓度成正相关性；但 PMR1缺失突变后胞内钙离子含量基本 不受 CQ 的影响，推测 PMR1p 可能是 CQ 的靶蛋白或 CQ 抑制了 PMR1的表达。 其次，用 RT-PCR 检测和荧光显微镜观察 CQ 对 PMR1转录和 PMR1-GFP 表达 的影响，结果表明 CQ 下调了 PMR1的表达。进一步探究发现 CQ 的抑制作用依赖 于转录因子 CRZ1。随后将 PMR1启动子区域（-1000~0bp）上含不同转录因子结 合域的三个片段分别插入荧光素酶标记基因（Ycplac33-Rluc）的起始密码子前， 荧光素酶检测表明 CQ 对转录因子 CRZ1p 与 PMR1启动子-918bp(b 段)区域的结合 起到调控作用而抑制 PMR1表达；同时通过 RT-PCR 及 CRZ1-GFP 的检测也证实了 CQ 抑制了 CRZ1p 的表达水平。 PMR1p 是内质网、高尔基体膜钙离子泵 ATPase，内质网是细胞内钙离子储 存的主要场所，其与内质网应激息息相关。所以，最后检测了 CQ 对内质网应激 的作用，结果发现 CQ 与 DTT 引起内质网应激机制不同，药物通过抑制 PMR1的 表达进而改变内质网钙离子内稳态来调控内质网应激反应。 综上所述， CQ 抑制了转录因子 CRZ1的表达，同时抑制 CRZ1p 与 PMR1启动 子的结合，从而抑制了 PMR1的转录，抑制了内质网/高尔基体对胞内钙离子的 利用及外排，促进了液泡对钙离子的吸收，导致胞内钙离子升高。 关键词：氯碘喹啉，酿酒酵母，离子稳态，调控机制 V STUDIES ON EFFECTS OF CLIOQUINOL ON CELLULAR METAL IONS HOMEOSTASIS ABSTRACT Mineral elements are necessary for organisms to survive. They are components of cells and play important roles in regulating physiological functions. However, when the balance of essential metal ions in the body