轮状病毒VP8蛋白与组织血型抗原的结合特性研究-临床检验诊断学专业毕业论文.docxVIP

摘要目的：通过基因工程技术表达六个轮状病毒(rotavirus，RVs)株 摘要 目的：通过基因工程技术表达六个轮状病毒(rotavirus，RVs)株 (Rotateq-p[8]、Rotateq—p[5]、Rotarix、RRV、LLR、P[14】)的VP8术 蛋白，以酶免疫分析实验(Enzyme immune assays，EIA)为基础建立 的唾液结合实验及寡糖结合实验研究不同P基因型毒株VP8*蛋白与组 织血型抗原(Histo．blood group antigens，HBGAs)的结合特性，为进 一步研究RVs．VP8*蛋白的功能特性、HBGAs在RVs感染过程中的作用 及新型RVs疫苗和防治药物的研发提供理论依据。 方法：(1)从Genbank中检索RVs疫苗Rotateq、Rotarix及Rotashield 相关病毒株的VP8*基因序列，并进行基因合成；(2)从RVs疫苗rotorway (罗特威)提取病毒株LLR核酸，用随机引物进行RT-PCR扩增； (3) P[141型轮状病毒株核酸，为本实验从患儿粪便标本提取所得；(4)设 计引物，通过PCR反应扩增6个病毒株的VP8*区基因序列，克隆至表达 载体pET-30a； (5)测序鉴定正确的重组表达质粒pET-30a-VP8术转化 大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，经IPTG诱导表达，用HisTrapa附FF亲 和层析柱纯化，通过SDS．PAGE电泳及Western．blot鉴定； (6)通过唾 液结合实验分析不同病毒株VP8*蛋白与携带不同HBGAs表型唾液的 结合特性；(7)根据寡糖结合实验分析不同病毒株VP8*蛋白与合成寡 糖A、B、Lea、Leb、Lex、Ley、Pre I、Pre II、H1、H2、H3的结合特 性。 万方数据 结果：(1)成功构建了6个RVs株VP8*编码区的重组表达质粒：pET-30a—Rotateq—P[8】一VP8术 结果：(1)成功构建了6个RVs株VP8*编码区的重组表达质粒： pET-30a—Rotateq—P[8】一VP8术 、pET-30a-Rotateq—P[5】-VP8木 pET-30a-Rotarix—VP8术、pET-30a-RRV-VP8木、pET-30a-LLR—VP8木、 pET-30a-P[14]．VP8*。 (2)成功表达了6个RVs株的重组VP8木蛋白： His—Rotateq-P[8】-VP8木、His-Rotateq-P[5】-VP8半、His-Rotarix-VP8术、 His-RRV-VP8*、His．LLR-VP8*、His—P[14]一VP8术，大小约为26kDa。(3) 重组蛋I兰tRotateq-P[8】一VP8木)5乏Rotarix—VP8木可以与A、B、AB及O型分 泌型唾液结合，不与非分泌型唾液结合；重组蛋I刍P[14]-VP8*与A、AB 型唾液有明显结合，与其它表型唾液均不结合；重组蛋白 His-Rotateq—P[51一VP8术、His-RRV-VP8冰、His-LLR—VP8水与唾液不结合。 (4)重组蛋I兰tRotateq—P[8】一VP8*及Rotarix-VP8木可以与Hl型HBGAs结 合，重组蛋白P[14]．VP8*与A型HBGAs特异性结合，重组蛋白 His—Rotateq-P[5】_VP8水、His-RRV-VP8木、His-LLR—VP8木与各型HBGAs 及唾液均不结合。 结论：(1)本研究利用原核表达系统成功表达了不同P基因型RVs 株的VP8*蛋白；(2)首次构建了唾液结合实验与寡糖结合实验用于轮 状病毒VP8*蛋白与组织血型抗原的结合特性研究； (3)RVs VP8*蛋 白与HBGAs的结合呈现株特异性，P[8]型RVs的VP8*蛋白与H1型 HBGAs结合，能够与分泌型唾液结合，不与非分泌型唾液结合；P[14】 型RVs VP8*蛋白特异性结合A型HBGAs，能够与A型和AB型唾液结合， 不与其它表型唾液结合，P[5】型Rotateq—P[5】一VP8*、P[3】型 Ⅱ 万方数据 His．RRV-VP8*及P[15】型His．LLR．VP8*与各型耶GAs及唾液均不结厶 His．RRV-VP8*及P[15】型His．LLR．VP8*与各型耶GAs及唾液均不结 厶 口。 关键词：轮状病毒；VP8*蛋白；组织血型抗原 m 万方数据 Abstractobjeetive：This Abstract objeetive：This research was designed to express the VP8木protein of six different RVs(Rotateq—P[8】、Rotateq—P[5】、Rotarix、RRV、L