里氏木霉中糖苷酶的理性改造对于二糖合成降解活性的影响-生物工程专业毕业论文.docxVIP

山东大学硕士学位论文3．2．6 山东大学硕士学位论文 3．2．6 Cellb蛋白及其突变体与不同二糖的共结晶分析 48 3．3本章小结 50 全文总结及展望 ．．53 参考文献 ．．57 附录 ．．63 致{射 ．．65 攻读学位期间取得的研究成果 ．．67 lI 万方数据 山东大学硕士学位论文p．葡萄糖苷酶(13-glueosidase)是一种重要的工业应用酶。它同时具有寡糖 山东大学硕士学位论文 p．葡萄糖苷酶(13-glueosidase)是一种重要的工业应用酶。它同时具有寡糖 水解和合成活性，既能水解寡糖生成相应的单糖，又能利用单糖合成寡糖。目前 对于D．葡萄糖苷酶的研究方向主要集中在提高其水解活性上，而对其合成活性的 研究相对较少。我们以里氏木霉胞内的B．葡萄糖苷酶Cellb蛋白作为研究对象， 希望通过理性改造提高其二糖合成活性以获得高效合成二糖的B．葡萄糖苷酶。我 们首先通过同源模建模拟得到了Cellb蛋白的三维结构，然后将Cellb蛋白和纤 维二糖进行柔性对接，结果显示纤维二糖的第二个葡萄糖残基处于一个相对亲水 的环境(如N240)中，而其周围仍存在部分疏水性氨基酸残基如W173，1174， 1177。我们据此提出了一个假说：D一葡萄糖苷酶的转糖基活性与其二糖结合部位 氨基酸的亲疏水性有关，结合部位的疏水性的降低可能有助于提高其转糖基活性。 我们进一步通过点突变技术对Cellb蛋白进行了定点突变，将其活性中心的疏水 性氨基酸变为了亲水性的氨基酸，获得了1177S、1177S／1174S、 1177S／1174S／ W173H等三株活性中心亲水性逐渐增强的蛋白；并在原始蛋白基础上将亲水性 氨基酸突变为疏水性氨基酸，获得了活性中心疏水性增强的蛋白N240I。 我们通过对上述理性改造获得的四个突变体蛋白进行二糖合成与水解活性 的鉴定，发现Cellb蛋白及其突变体利用葡萄糖为底物可以合成昆布二糖、纤 维二糖和槐糖三种二糖。当活性中心的亲水性增加时，其二糖合成活性增加，水 解活性降低；当结合位点的疏水性增加时，其二糖合成活性消失，而水解活性保 持不变。其中，1177S／1174S／W173H突变蛋白的槐糖最大产量达到了25∥L。 这一实验结果证实了我们上述Cellb蛋白活性中心亲疏水性对二糖合成／水解活 性影响的假说，并以此假说为出发点，通过理性改造获得了一株高效合成昆布二 糖和槐糖的p．葡萄糖苷酶。这对以后p．葡萄糖苷酶的定向改造及其催化机制的 研究具有重要指导意义。 关键词：p．葡萄糖苷酶；理性改造；合成活性；催化机理 万方数据 山东大学硕士学位论文Abstract 山东大学硕士学位论文 Abstract The fl-glucosidase is an important industrial enzyme．Many reports proved that 13-glucosidase is a bifunctional enzyme and it not only hydrolyzes the oligosaccharides and its derivatives but also plays a role of transglycosylation in synthesis of oligosaccharides．Most studies of 13一glucosidase focused on the hydrolytic activity,but there were few reports about its synthetic activity．In this study,Cel l b，a kind of fl-glucosidase derived from Trichoderma reesei，was chosen for improving the synthetic activity of disaccharides produced by rational design．The three-dimensional structure of Cel l b Was built by homology modeling．The structure of Cel l b wim cellobiose bind to its active site Was predicted by flexible docking．It was shown that the outer glucose moiety of cellobiose Was surrounded by a generally hydrophilic binding pocket．The hydrophobic residues that