儿童重症监护室肺炎克雷伯菌产ESBLs菌株的耐药基因及其流行病学研究.doc

贵阳医学院 2014 届硕士研究生论文 表 2. 产 ESBLS 肺炎克雷伯菌耐药基因特异性引物 Table2. The primers for the special drug resistance genes of ESBLs K. pneumoniae 扩增基因型 引物序列 扩增片段 长度（bp） TEM F：5-TTAGACGTCAGGTGGCACTT-3 R：5-GGACCGGAGTTACCAATGCT-3 966 SHV F：5-TCGGCCTTCACTCAAGGATG-3 R：5-ATGCCGCCGCCAGTCATATC-3 928 CTX-M F：5-GGCCCATGGTTAAAAAATCACTGC-3 853 R：5-CCGTTTCCGCTATTACAAACCGTTG-3 DNA 模板的制备 将产 ESBLs 肺炎克雷伯菌菌接种至含抗生素头孢噻肟（1μg/ml）的 LB 培养基中，于 37℃摇床充分震荡培养 12-16h。 取 1.5ml 菌液，于室温，8000×g 离心 2min 收集菌体。 在菌体沉淀中加入 250μl Buffer P1，震荡至彻底悬浮菌体。 加入 250μl Buffer P2，立即温和颠倒离心管 5~10 次混匀，室温静置 2~4min。 加入 250μl Buffer P3, 立即温和颠倒离心管 5~10 次充分混匀。 于离心机最大转速（≥12000×g）离心 5-10min，将上清全部小心移 入吸附柱，9000×g 离心 30sec,倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集 管中。 在吸附柱中加入 500μl 去蛋白液 Buffer DW1, 9000×g 离心 30sec，倒 掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。 向吸附柱中加入 500μl Wash Solution，9000g×30sec，倒掉收集管中的 液体，将吸附柱放入同一个收集管中。 重复步骤 8 一次。 将空吸附柱和吸收管放入离心机，9000×g 离心 1min。 在吸附柱中央加入 50~100μl Elution Buffer，室温静置 1~2min, 9000 ×g 离心 1min，将所得到的质粒 DNA 溶液置于-20℃保存或后续实验。 PCR 反应体系：反应体系的组成成分及其体积见表 3。 9 贵阳医学院 2014 届硕士研究生论文 表 3. PCR 反应体系 Table3. reaction system 扩增体系组成 体积（μl） Taq PCR Master Mix 25 DNA template 1 Primer F(10uM) 2 Primer R(10uM) 2 Nuclease-free ddH2O 20 反应步骤及条件 所有引物扩增步骤及条件按表 7 操作，（2）-（5）步骤 重复 35 个循环(见表 4)。 表 4. PCR 反应步骤及条件 Table 4. PCR reaction steps and conditions 反应步骤 温度设置 反应时间 （1）预变性 95℃ 5min （2）变性 95℃ 45sec （3）退火 56℃ 45sec （4）延伸 72℃ 1min （5）循环 GOTO （2） （6）延伸 72℃ 10min （7）保存 4℃ Forever 琼脂糖凝胶电泳 胶板制备过程已经加入核酸染料（goldview），PCR扩增产物直接在 1.5% 琼脂糖凝胶进行电泳（120V，50min）。分子量 100～2000bp的 DNA Marker作参 照，紫外分析仪观察结果，DNA存在处应显出荧光条带，观察 DNA带的泳动位置， 拍摄凝胶照片（见图 2）。大肠埃希菌（ATCC25922）DNA作为各种阴性对照, 肺 炎克雷伯菌产 ESBLs的 SHV、TEM、CTX-M型菌株 DNA作为阳性对照。 5. PCR 测序产物分析与测序 10 贵阳医学院 2014 届硕士研究生论文 从 PCR产物扩增阳性组中随机挑选 6株 PCR扩增阳性产物委托上海生物工程 有限公司对 PCR产物进行纯化测序，采用 Sanger双脱氧末端终止法，通过 ABI PRISM 3730XL型测序仪对纯化后产物进行直接双向测序, 了解携带的耐药基因。 结果 1．产 ESBLS 肺炎克雷伯菌耐药基因 PCR 扩增结果 （1）产 ESBLS 肺炎克雷伯菌耐药基因的检出率：本次共检测到 29 株产 ESBLs 肺炎克雷伯菌的 3 种耐药基因型，分别为：TEM 型、CTX-M 型、SHV 型。其中检出率最高的是 SHV 型 93.1%（27/29），其次是 TEM 型 51.7%（15/29） 和 CTX-M 型 37.9%（11/29）（见表 5）。 表 5. 29