太白银莲花皂苷-A对人胶质瘤U87细胞作用及机制的研究.docVIP

第四军医大学硕士学位论文 4．透射电子显微镜观察太白银莲花皂苷-A 处理后U87 细胞超微结构变化。 5．AnnexinV/IP 双染，流式细胞仪检测太白银莲花皂苷-A 处理后U87 细胞凋亡比率。 6．免疫印迹（Western blot）法，检测凋亡相关分子 Fas、Fas-L、Pro-caspase8、 Pro-caspase3、Bcl-2、Bax 等分子的表达，探讨太白银莲花皂苷-A 致U87 细胞凋 亡的机制。 结果 极低浓度太白银莲花皂苷-A 溶液(1, 2, 4，8μg/ml)处理后，U87 细胞生存率明显下 降，并呈浓度依赖性，而正常人血管内皮细胞VEC304 生存率未受到显著影响。 流式细胞仪检测数据分析显示太白银莲花皂苷-A 处理后分布于 S 期的 U87 细胞 数量明显增多，G1 期细胞分布比率相应下降。 Hoechst33342 核染色试验中，U87 细胞经不同浓度（0，1.13μg/ml, 1.75μg/ml, μg/ml）太白银莲花皂苷-A 处理后6 小时，即可见典型细胞凋亡形态学变化， 包括：核碎裂，染色质浓集，细胞萎缩，包膜完整性破坏或变形等。并且这一现 象随浓度增加及处理时间延长更加明显。 电子显微镜观察到U87 细胞经太白银莲花皂苷-A 处理12 小时后出现典型且普遍 的染色质边集现象；处理24 小时后，凋亡小体出现明显增多。 流式细胞仪分析显示，U87 细胞经太白银莲花皂苷-A（1.75ug/ml）分别处理6,12,24 小时后，早期凋亡细胞比率逐渐增多，呈明显时间依赖性。 免疫印迹试验检测发现，太白银莲花皂苷-A（1.75ug/ml IC50）处理 U87 细胞 6,12,24 小时后，Fas 以及 FasL 蛋白表达均逐渐上调，而 caspase-8 前体以及 caspase-3 前体均呈明显的逐渐下降趋势，具有时间依赖性。Caspase-8，-3 活化片 段均可被检测，并且前者出现的表达峰值较早（处理后6 小时）。Bcl-2 表达没有 明显的变化。Bax 蛋白的表达在本实验中未检测出。 结论 太白银莲花皂苷-A 可以在极低浓度下可抑制胶质瘤 U87 细胞增殖，而相应低浓 度下对正常血管内皮VEC304 细胞没有表现出影响，因此具有特异的抑制胶质瘤 增殖的生物活性。 5 第四军医大学硕士学位论文 太白银莲花可以导致 U87 细胞 S 期阻滞，说明太白银莲花皂苷-A 导致的胶质瘤 增殖抑制与其周期阻滞活性有关。目前细胞S 期阻滞机制尚不明确，因此该种化 合物极具科研研究价值。 通过实验我们证实了，太白银莲花皂苷-A 可以在体外诱导 U87 细胞凋亡，其诱 导凋亡发生的效果具有浓度及时间依赖性。 在对太白银莲花皂苷-A 诱导凋亡机制的研究中，我们发现多种凋亡相关蛋白的表 达与Fas 凋亡通路机制吻合，考虑该种药物诱导细胞凋亡的机制与Fas/FasL 相关 的死亡受体凋亡通路有关。 综合上述研究，太白银莲花皂苷-A 具有极强的致肿瘤细胞凋亡及增殖抑制活性， 因而具有很好的药物研究价值。 6 第四军医大学硕士学位论文 Function and mechanisms of triterpenoid taipaienoside-A on human glioma U87cells Candidate for master:Liu Ning Supervisor:Cheng Guang Department of Neurosurgery,Xijing hospital, Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, China Sponsored Programs: National Natural Science Foundation of China (No Abstract Keywords Taipaienoside-A，Triterpenoid，Glioma，U87 cell lines，proliferation, Apoptosis Objective Recently we isolated several novel triterpenoid saponins from the root of Anemone taipaiensis (the species distributed locally in Qinling Mountains of China), and found taipaienoside A possess remarkably proliferation-inhibiting activity in glioblastoma cells in preliminary