两型TNF-α对荷瘤小鼠MDSC免疫抑制功能的影响-分子免疫学专业毕业论文.docxVIP

华中科技大学博士学位论文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 PAGE 10 PAGE 10 中 文 摘 要 髓系来源抑制细胞( myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)是未分化成熟的、异 质性的、具有免疫抑制功能的髓系细胞群体。肿瘤组织中被证实有MDSC的大量聚集， 该群细胞通过抑制肿瘤免疫，而促进肿瘤的发生和发展。多种肿瘤组织来源的炎性因 子如IL-1β、IL-6、PGE2、VEGF等参与MDSC的诱导和募集，肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor，TNF-α）作为促炎细胞因子，在肿瘤微环境中，被广泛表达于肿瘤相 关巨噬细胞（TAM)、肿瘤细胞和肿瘤间质细胞，在肿瘤的发生和发展中发挥重要作 用。但迄今为止，TNF-α对MDSCs的影响尚不清楚。本研究旨在探讨跨膜型和分泌型 TNF-α（tmTNF-α 和sTNF-α）对肿瘤MDSC免疫抑制功能的影响及其分子机制，为肿 瘤治疗提供新线索。主要结果如下： 第一部 体外两型 TNF-α对荷瘤小鼠 MDSCs 功能的影响 用 Percoll 密度梯度离心法和 Gr-1 抗体包被的磁珠分离纯化荷瘤小鼠脾脏细胞的 MDSCs，经流式细胞术鉴定其纯度达 95%以上。 一、荷瘤小鼠 MDSC 自身 TNF-α 和 TNFR 的表达 用 RT-PCR 的方法和流式细胞术分别从 mRNA 水平和蛋白质水平检测 MDSC 自 身 TNF-α 和 TNFR 的表达。结果表明：无论在 mRNA 水平还是在蛋白质水平，荷瘤 小鼠 MDSCs 表达的 TNF-α 和两型 TNFR 均明显高于正常小鼠的 MDSCs（p0.05）， 且以 TNFR2 表达为主。 二、体外两型 TNF-α对荷瘤小鼠 MDSCs 功能的影响 1．外源性 tmTNF-α促进 MDSCs 转录 iNOS mRNA 及分泌 NO：用两型 TNF-α 刺激 荷瘤小鼠 MDSCs 16 h，结果显示 sTNF-α 明显抑制 MDSC 转录 iNOS mRNA 和分泌 NO（p0.05），而 tmTNF-α 则明显促进 MDSC 转录 iNOS mRNA（约 1.6 倍）和释放 NO（约 2.5 倍）。当用抗体中和 tmTNF-α 后，iNOS mRNA 和 NO 的水平恢复至对照 的基础水平。 2．两型 TNF-α均可促进 MDSCs 转录 ARG1 mRNA：采用 real-time PCR 技术观察两 型 TNF-α对 MDSCs 转录 ARG1 mRNA 的影响，结果显示：sTNF-α明显增加 MDSCs 的 ARG1 mRNA 水平（约 4 倍）（P0.05），而 tmTNF-α则轻度提高 ARG1 mRNA 水 平（约 1.5 倍）。 3．两型 TNF-α对 MDSCs 分泌抑制性细胞因子 IL-10 和 TGF-β的影响：采用 ELISA 法比较两型 TNF-α对 MDSCs 分泌 IL-10 和 TGF-β的影响。结果显示：tmTNF-α可明 显促进 MDSC 分泌 IL-10 和 TGF-β（P0.01），而 sTNF-α则仅能刺激 MDSC 分泌 TGF-β， 对其产生 IL-10 则无影响。 4．tmTNF-α可促进 MDSCs 抑制 T 细胞增殖 由于 tmTNF-α对 MDSC 的刺激作用明显高于 sTNF-α，故我们进一步观察用 tmTNF-α刺激 MDSCs 的培养上清是否能够有效抑制 PMA 和 Ionomycin 联合诱导的 T 细胞增殖。结果显示：MDSC 培养上清可明显抑制 T 细胞增殖（抑制率 50%），而经 tmTNF-α刺激的 MDSCs 培养上清的抑制作用明显增强（抑制率 80%），该促进作用 可被 TNF 抗体或 IL-10 抗体完全阻断。该结果充分提示：tmTNF-α能通过促进 MDSCs 分泌 IL-10 等抑制性细胞因子，增强 MDSCs 对 T 细胞增殖的抑制作用。 三、tmTNF-α 促进 MDSCs 发挥免疫抑制作用的分子机制 1．tmTNF-α 通过诱导 p38 磷酸化促进 MDSCs 的抑制功能：用 Western blotting 观察 两型 TNF-α 对荷瘤小鼠 MDSCs 的 MAPK 家族中信号分子的影响。结果显示：两型 TNF-α 对 MDSC 的 ERK 和 JNK 磷酸化水平均无明显影响，但可促进 p38 磷酸化，其 中 tmTNF-α 的刺激作用明显强于 sTNF-α，用抗体中和 tmTNF-α 可完全阻断其作用。 提示 tmTNF-α 对 MDSC 的促进作用可能与 p38 通路相关。 用 p38 特异性抑制剂 SB203580 预处理 MDSCs，可完全阻断 tmTNF-α