山东和安徽地区三种蔬菜病毒检测与鉴定-植物保护专业论文.docxVIP

2．2．1植物总DNA提取 2．2．1植物总DNA提取 15 2．2．2引物的合成 ．15 2．2．3 PCR扩增 16 2．2．3．1外壳蛋白的PCR扩增 ．．16 2．2．3．2全基因组及小分子卫星D】叮A的PCR扩增 17 2．2．4 PCR产物的克隆与测序 18 2．2．4．1琼脂糖凝胶电泳与DNA片段回收 。1 8 2．2．4．2连接载体 ．19 2．2．4．3大肠杆菌感受态细胞的制备 ．．19 2．2．4．4连接产物转化大肠杆菌 。20 2．2．4．5提取质粒DNA 20 2．2．4．6重组质粒鉴定 ．．21 2．2．4．7序列分析 。21 2．3番茄褪绿病毒的检测与鉴定 22 2．3．1引物的设计与合成 ．22 2．3．2植物总RNA提取 ．22 2．3．3反转录cDNA的合成 24 2．4．4 RT_PCR扩增 一25 2．4辣椒轻斑驳病毒的检测与鉴定 25 2．4．1引物的设计与合成 ．25 2．4．2植物总砌妊提取 ．26 2．4．3反转录cDNA的合成 26 2．4．4 RT-PCR扩增 ．．26 2．3．5 PCR产物的克隆及测序 27 3结果与分析 27 3．1番茄黄化曲叶病毒及其伴随卫星DNA的检测 ．27 3．1．1 1’YLCV在山东、安徽两省发生情况检测 27 3．1．2伴随卫星DNA的检测 。29 万方数据 3．2番茄褪绿病毒的检测与鉴定(乃m口幻c办fD聊西Vf，伽，ToCV) 3．2番茄褪绿病毒的检测与鉴定(乃m口幻c办fD聊西Vf，伽，ToCV) ．．30 3．2．1番茄褪绿病毒在山东及安徽两省的发生情况 ．30 3．2．2番茄褪绿病毒与黄化曲叶病毒的复合侵染 ．31 3．2．3番茄褪绿病毒分离物CP与HSP70的测定分析及系统进化树构建 ．32 3．2．4番茄褪绿病毒分离物CP与HSP70的选择压力分析 ．34 3．3辣椒轻斑驳病毒的鉴定 37 3．3．1辣椒轻斑驳病毒扩增惭硎泓掰D娩v泐，PMMoV夕 ．．37 3．3．2辣椒轻斑驳病毒序列测定和分析 ．38 4讨论与结论 ．．40 4．1番茄黄花曲叶病毒的讨论与结论 ．40 4．2番茄褪绿病毒的讨论与结论 ．40 4．3辣椒轻斑驳病毒的讨论与结论 41 参：考文献 43 致谢 ． ．． ．． ．．51 万方数据 山东农业大学硕士学位论文中文摘要 山东农业大学硕士学位论文 中文摘要 番茄及辣椒都是重要的经济作物，近年来病毒病的爆发导致了番茄和辣椒产量减少 和品质的降低，造成了严重的经济损失。随着各种检测手段的发展，我们可以更迅速、 更便捷的鉴定病毒病的种类，并采取相关措施挽回经济损失。 本研究以番茄黄花曲叶病毒(死m口幻声踟w＆矽c掰一订r孵，1YLCV)、番茄褪绿病毒 (而m口幻幽肠聊妇伽谢，ToCV)及辣椒轻斑驳病毒(A御盯m砌肌D砒伽w，PMMoV) 为对象，用分子检测方法完成山东、安徽两省病原的鉴定。我们选取山东、安徽两个省 7个地区，针对3种病毒病进行田间调查，采集疑似样品扩增序列，对其进行同源性比 对和遗传进化树等分析，进一步了解山东、安徽两省蔬菜产区3种病毒病的发生情况。 主要研究结果如下： 1、通过对山东省、安徽省TYLCV发生情况的调查及检测可知，目前TYLCV在山 东省大部及安徽省局部已经发生扩散。构建的聊．Cv系统进化树可以分为IL、m、 Mild、Gez 4组，其中本研究的4个分离物和中国所有的分离物一起聚类在Ⅲ组。对感 病TYLCV样品进行卫星DNA的检测，没有获得明显目的条带。 2、通过ImPCR检测及序列分析，首次确定ToCV在安徽地区发生，且统计发现两 省六个地区ToCV、TYLCV存在单独侵染及复合侵染。分别基于TOCV CP和TOCV HsP70 构建系统进化树，结果发现TOCV分离物都可分为两个大组，其中本研究所得到的分离 物均与中国其他地区的分离物聚类到I组。通过计算分离物ToCV的CP与HSP70两个 基因的同义突变(dS)和非同义突变(dN)的比率(dN／dS)，结果显示，CP与HSP70 基因均处于负向(或净化)选择的压力之下且所承受的压力不同。 3、通过对山东济宁辣椒的田间调查发现，PMMoV在辣椒叶片上呈现轻微的褪绿 或者斑驳症状。对山东济宁辣椒病株进行R11-PCR扩增，经鉴定，确定其病原为PMMoV， 表明感病的济宁辣椒样品确系被PMMoV感染。并与日本分离物0蟠062054)、广西分离 物(】四877405)2个序列同源性最高均达到99．2％。基于CP构建的系统进化树发现济宁分 离物与中国其他分离物聚类到I组，与中国北京分离物(PMMoV-CN)最为相近。 关键词：番茄曲叶病毒，番茄褪绿病毒，辣椒轻斑驳病毒，分子鉴定，复合侵染 万方数据 万方数据 万方数据 山东和安徽地区三