利用大肠杆菌发酵制备siRNA及其在抑制乙型肝炎病毒复制中的应用-生物化学与分子生物学专业论文.docx

博士论文：利用大肠杆菌发酵制各siRNA及其在抑制乙型肝炎病毒复制中的应用摘 博士论文：利用大肠杆菌发酵制各siRNA及其在抑制乙型肝炎病毒复制中的应用 摘 要 RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指双链RNA特异性地诱发与其序列同 源的mRNA分子被降解，从而抑制基因表达的现象，是一种特殊的转录后基因表 达沉默(post transcriptional gene Silence，PTGS)现象。其高效专～地抑制 特定基因表达沉默的特点使RNA干扰技术被广泛应用于基因功能研究。近年来在 细胞和动物体系中进行的抗肿瘤和抗病毒等应用研究表明，RNA干扰技术在疾病 治疗领域同样具有诱人的应用前景。然而要将该技术成功应用于临床实践，仍有 几个关键问题需要解决，其中之～是如何以较低的成本大规模制备siRNA。本论 文的工作针对这一关键问题提出了一种新的siRNA制备方法。并成功利用以该方 法制备的SiRNA抑制了乙型肝炎病毒(HBV)在人肝癌细胞以及小鼠肝脏内的复 制。 第一章中的工作建立了利用大肠杆菌表达并纯化目的基因双链RNA的方法。 其方法是构建了带有双向T7和tac启动子的表达载体，然后将目的基因片段插 入到位于两个启动子之间的多克隆位点中。得到的重组质粒能够在大肠杆菌宿主 菌中高效表达双链f{NA。通过改变诱导时的菌液浓度以及诱导时间优化了发酵条 件。发酵菌体中的双链RNA通过cF一11亲和层析柱纯化得到。 第二章中的工作包括制各大肠杆菌IⅡ型RNA水解酶并优化其水解双链RNA 的条件以及建立用离子交换层析和分子筛层析分离纯化水解得到小片段RNA的 方法。N端带六个组氨酸标记的大肠杆菌ⅡI型RNA水解酶(His—RNase III)利用 pET一30a表达载体得到表达，通过Ni”螯合亲和层析柱进行纯化。在将水解反应 体系中的Mg”用Mn”替代以后，His—RNase Ill可以将双链RNA水解为以21 bp为 主的小片段RNA，称为esiRNA。反应体系中His—RNase llIig底物双链RNA的用 量以及Mn2+浓度三者之间必需保持合适的比例，改变任何一种因素都会影响 esiRNA的得率。水解混合物中的esiRNA通过DEAE树脂离子交换层析以及分子 筛层析得到纯化。在第四章中实现了裂殖酵母Dicer羧基端RNase HI结构域在 大肠杆菌中的表达，实验数据表明它能够在体外反应中将长双链RNA水解成2l bp左右的siRNA，但是其表达量不高，酶活性偏低，不适合用于siRNA的大规模 制各。 第三章中的工作首先验证了用新方法制各的esiRNA能够在哺乳动物细胞中 特异而高效地抑制同源基因的表达。在SMMC7721和293T细胞中，绿色荧光蛋白 的表达被同源的esiRNA特异性地抑制。在此基础上，针对HBV基因重叠的特点 和病毒DNA序列的保守性，用软件分析预测选定位于S基因和x基因编码序列之 间的HBV聚合酶编码序列来制备esiRNA(siHBVP)。在HepG2细胞中，siHBVP剂 博士论文：利用大肠杆菌发酵制各siRNA及其在抑制乙型肝炎病毒复制中的应用量依赖性地抑制乙型肝炎病毒表面抗原的分泌表达，其最高抑制率在单次转染 博士论文：利用大肠杆菌发酵制各siRNA及其在抑制乙型肝炎病毒复制中的应用 量依赖性地抑制乙型肝炎病毒表面抗原的分泌表达，其最高抑制率在单次转染 7．5 nM SiHBVP后的6天内维持在80％左右。在用尾静脉液压法观察siHBVP抑 制乙型肝炎病毒在ICR小鼠肝脏内的复制时，与没有注射siHBVP的对照小鼠相 比，血清表面抗原和e抗原的水平均被抑制，最高抑制率分别达到90％和70％。 对HBsAg的抑制效率在单次注射后的七天内维持在80％以上。与已报道的针对 HBV的SiRNA相比，在抑制效率和持续时间方面，本论文中制备的SiHBVP均显 示出明显的优越性。 总之，本论文提出了一种简便、高效、低成本的siRNA制备方法。在抑制乙 型肝炎病毒复制的初步应用研究中，该方法显示出了其优越性。该方法有望在阐 明基因功能的基础研究领域以及在抑制疾病相关基因的应用研究领域发挥重要 的作用。 关键词：HBV，RNAi，Pd、『aseⅢ，siRNA ABSTRACT RNA interference，the process of specific mRNA degradation induced by homologous dsRNA，has been widely used for target—specific gene silencing，and holds great therapeutic potential in clinical applications，especially