商陆抗病毒蛋白抑制乙型肝炎病毒复制的研究-内科学(传染病)专业论文.docx

华 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 PAGE 12 PAGE 12 商陆抗病毒蛋白抑制乙型肝炎病毒复制的研究 华中科技大学同济医学院附属协和医院感染性疾病科 博士研究生：陈西柳 导师：贺永文 教授 中文摘要 第一部分 天然 PAP-S 的制备及其毒性研究 目的：从美洲商陆种子中提取天然 PAP-S，研究其对小鼠的急性及亚急性毒性。 方法： 采集美洲商陆种子，粉碎后加蒸馏水搅拌离心。上清液通过酸碱柱 CM-Sephadex C-50 分离酸性及碱性蛋白，碱性蛋白通过分子筛 Sehpadex G-50 柱收集 第一洗脱峰，浓缩后通过酸碱柱 CM-Sephadex C-52 再次分离酸碱性蛋白，收集第二 洗脱峰。SDS检测分子量，BCA 法测定蛋白质浓度。将 80 只昆明小鼠随机分为 8 组，单次腹腔注射 PAP-S，每组浓度分别为 0.5、0.7、1、1.4、2、2.8、4、5.6mg/kg， 观察注射后 14 天内小鼠的健康状况及死亡率。40 只昆明小鼠随机分为 4 组，连续 14 天腹腔注射 PAP-S，浓度分别为 0、0.125、0.25、0.5mg/kg，停药一天后采血检测血 清 ALT、BUN 水平，取肝、肾组织做 HE 染色。 结果： 洗脱后得到分子量约为 30KD 的单一条带，冻干后得到约 200mg 粉末。取 1mg 粉末溶于 1ml 生理盐水，BCA 测得蛋白浓度为 0.6mg/ml。小鼠的急性毒性实验显 示 3 天和 14 天时 LD50 分别为 2.41 和 1.75mg/kg。亚急性毒性试验显示，高浓度 PAP-S 组血清 ALT 水平较阴性对照组轻度升高，但各组间 BUN 水平无显著性差异。HE 染色未 见明显病理变化。 结论： 成功制备了天然 PAP-S。低浓度 PAP-S 无明显肝肾毒性。 关键词：商陆种子抗病毒蛋白；急性毒性实验；亚急性毒性试验 第二部分 天然 PAP-S 体内抑制 HBV 复制的研究 目的：探讨天然 PAP-S 在 HBV 转基因小鼠模型体内抗 HBV 的效果。 方法：给药前，将 24 只 HBV 转基因小鼠按照血清 HBV DNA 和 HBsAg 水平配对， 分为阴性对照组、拉米夫定组、PAP-S 0.125mg/kg 及 0.25mg/kg 组。持续给药 45 天， 于给药第 15、30、45 天及停药 15 天后自眼眶静脉丛采血，荧光定量 PCR 法检测小鼠 血清中 HBV DNA 含量，ELISA 法检测血清 HBsAg 水平；取肝、肾组织，行 HE 染色 观察给药后小鼠肝、肾组织的病理变化，免疫组化染色计算肝脏 HBsAg 阳性细胞的数 量，real time RT-PCR 测肝组织中 HBV 复制中间体 mRNA 含量。 结果： 与生理盐水组相比，45 天时拉米夫定组、PAP-S 0.125mg/kg、0.25mg/kg 组对血清 HBV DNA 的抑制率分别为 75.7%（P﹤0.01）、68.9%（P﹤0.01）、78.7%（P ﹤0.01）；对 HBsAg 的抑制率分别为 29.7%（P﹤0.01）、23.3%（P﹤0.01）、36%（P﹤ 0.01）。各组肝肾组织 HE 染色均未见明显病理变化。免疫组化染色显示 PAP-S 组小鼠 肝脏组织中 HBsAg 阳性细胞数量较生理盐水组减少。RT-PCR 结果显示天然 PAP-S 组 HBV mRNA 水平被抑制。 结论： 0.125 及 0.25mg/kg 天然 PAP-S 在慢性乙肝病毒感染小鼠模型中对 HBV DNA、HBsAg、HBV mRNA 有抑制作用。 关键词：商陆种子抗病毒蛋白；乙型肝炎病毒；HBV 转基因小鼠；抗病毒 第三部分 全长及不同片段缺失型 PAP 基因及与 HBV 核心蛋白 融合原核表达质粒的构建及蛋白纯化 目的： 构建全长及不同片段缺失型 PAP 基因原核表达质粒及与 HBV 核心蛋白融 合的 PAP 原核表达质粒，并进行蛋白纯化。 方法：以 PGEM-PAP 质粒为模板设计引物，PCR 扩增得到全长及不同片段缺失型 PAP 基因，经酶切、连接后测序确认。以已测序的全长及不同片段缺失型 PAP 质粒及 HBc 质粒为模板设计引物，PCR 扩增 PAP-HBc 融合基因，与 PMD-18T 载体连接并转化， 经酶切鉴定及 DNA 序列检测均证实为目标序列。将原核载体 pET-28a 与构建好的克隆 用 BamH I 和 Hind Ⅲ 双酶切，连接酶切产物，经测序证实得到 pET-28a-PAP-HBc 原 核质粒。将全长 PAP、全长 PAP-