两个先天性白内障家系的致病基因筛查与功能研究-眼科学专业论文.docxVIP

福建医科大学硕士学位论文 福建医科大学硕士学位论文 目 录 中文摘要 1 Abstract 3 前言5 缩略语 7 第一部分 先天性白内障家系 1 和家系 2 的遗传学分析 8 1.前言 8 2.材料和方法9 3.结果10 4.讨论11 5.小结12 6.参考文献12 第二部分 先天性白内障家系 1 的相关候选基因突变筛查 15 1.前言15 2.材料和方法16 3.结果22 4.讨论 25 5.小结 26 6.参考文献26 第三部分 CX50 野生型及突变型基因表达载体的构建 27 1.前言28 2.材料和方法29 3.结果35 4.讨论36 5.小结 37 6.参考文献 37 第四部分 突变基因功能研究 39 1.前言39 2.材料和方法40 3.结果43 4.讨论 47 5.小结48 6.参考文献48 第五部分 先天性白内障家系 2 的相关候选基因突变筛查 51 1.前言 51 2.材料和方法 52 3.结果 60 4.讨论 63 5.小结 65 6.参考文献68 综述71 致 谢84 PAGE PAGE 1 两个先天性白内障家系的致病基因筛查与功能研究 中文摘要 研究目的： 本研究的目的是筛查两个不同表型的双侧先天性遗传性白内障中国家系的致 病基因，并且仔细分析突变的分子和细胞机制。 研究方法: 两个家系所有的家庭成员经过完整的眼科和其他系统的临床检查，记录详细 的家族史和临床数据，获得所有家庭成员的知情同意后，收集患者和正常人的血 样，基因组 DNA 从外周血白细胞中提取，家系 1 选择先天性白内障高致病基因为 候选基因，设计特异性的引物（包含外显子和两侧的内含子区域），进行 PCR 扩 增，直接测序筛查突变。利用 DNA 体外重组技术，构建 CX50 野生型基因表达载 体，然后利用定点突变技术，完成 CX50 突变基因表达载体的构建，转染 293 细 胞，通过共聚焦显微镜评估重组蛋白的表达和分布。家系 2 选取白内障相关的多 态性微卫星遗传标记，设计并合成引物，利用梯度聚合酶链反应扩增 DNA 片断， 8%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 DNA 片断，依据电泳结果进行基因分型，利用等位 基因共享分析及测序对候选基因进行排除性定位。 研究结果： 根据候选基因编码区测序结果显示家系 1 的 GJA8 基因的 94 位碱基有一个杂 合的颠换，导致了 CX50 编码序列高度保守的 32 位氨基酸由苯丙氨酸替换为异亮 氨酸。这个新的突变出现在常染色体显性先天性全白内障的家系中所有的病人中， 其他正常的家庭成员中没有发生突变。当表达在 293 细胞中时，CX50 与 GFP 形 成融合蛋白，通过共聚焦显微镜观察到的结果显示：无论是野生型的还是突变体 都有间隙连接斑块的形成，并且两者没有量的差别，在细胞膜和细胞质中都能观 察到点状的分布。家系 2 中 GJA3 基因的 130 位碱基有一杂合的转换导致了蛋氨 酸对缬氨酸的取代，从而破坏了蛋白质的功能。 研究结论: 家系 1 中在 GJA8 的第一细胞外基质结构域发现了一个新的突变，我们的发 现更近一步扩大了常染色体显性先天性全白内障相关的突变谱。本研究家系 1 鉴 定的突变的氨基酸的替换位于第一跨膜区，细胞连接斑块的数量和亚细胞定位没 有改变，研究的结果提示这个突变通过其他的致病机制导致白内障的形成。家系 2 的研究结果确认了 p.V44M 可以导致先天性皮质性白内障。 关键词：先天性白内障；基因突变；缝隙连接蛋白；缝隙连接 Screening disease-causing mutations in two families with hereditary congenital cataract and study of function Abstract Purpose: The aim of the study was to screen for the disease-causing mutations in two Chinese families with different phenotypes of bilateral hereditary congenital cataract and to dissect the molecular and cellular consequence of the novel mutation. Methods: All members of two families underwent a full ophthalmic