课件：乳腺癌基因治疗的研究进展.pptVIP

* 制备重组逆转录病毒 RevTRE/HSVtk 和 RevTet-On，然后通过逆转录病毒感染靶细胞，将 Tet-On 基因调控系统中的反应元件 TRE 和 rtTA 调控元件共同整合到同一宿主细胞中，使目的基因导入靶细胞，并处于 Tet-On 基因的有效调控，同时也提高了外源目的基因的转导效率。 * 病毒感染细胞基因组 DNA 的提取与酶切 图 17 病毒感染细胞基因组 DNA 的提取与酶切图 M：Lambda DNA/EcoRI+ Hind Ⅲ DNA Marker； 1： 逆病毒 RevTRE/HSVtk 和 RevTet-On 感染 MCF-7 细胞基因组 DNA； 2： MCF-7 细胞基因组 DNA； 3： MCF-7 细胞基因组 DNA EcoRI酶切； 4： 逆病毒 RevTRE/HSVtk、RevTet-On 感染 MCF-7 细胞基因组 DNA EcoRI酶切 * 逆病毒感染细胞 Southern印迹杂交分析 M 1 2 3 图 18 细胞 Southern 印迹杂交分析图 M： 100 bp ladder marker； 1： MCF-7 细胞； 2： 逆病毒 RevTRE/HSVtk、RevTet-On 一次感染的 MCF-7 细胞； 3： 逆病毒 RevTRE/HSVtk、RevTet-On 重复感染的 MCF-7细胞 * 利用微乒乓感染的方法将制备的重组逆转录病毒 RevTRE/HSVtk 和 RevTet-On 导入乳腺癌细胞株 MCF-7 细胞。实验中观察到，HSVtk 基因的表达受 Dox 的诱导调控，随着 Dox 的浓度增高，GCV 对乳腺癌细胞的杀伤能力加强。 * 台盼蓝排斥试验和细胞计数分析检测细胞活力 图 19 不同 Dox 浓度诱导下台盼蓝排斥试验和细胞计数 * MTT 法检测重组病毒感染的 MCF-7 细胞不同药物浓度诱导 24 h 的存活率 n=4 n=4 * 流式细胞分析 图 20 流式细胞仪 （FCM）检测细胞凋亡图 1： MCF-7 细胞； 2： 逆病毒 RevTRE/HSVtk、RevTet-On 感染的 MCF-7 细胞； 3： 1μg/ml Dox、2μg/ml GCV 作用 48 h 的逆转录病毒感染 MCF-7 细胞 * 流式细胞仪 （FCM）检测细胞周期 图 21 流式细胞仪 （FCM）检测细胞周期图 1： MCF-7 细胞； 2： 逆病毒RevTRE/HSVtk、RevTet-On 感染的 MCF-7 细胞； 3： 1μg/ml Dox、2μg/ml GCV作用 48 h 的逆转录病毒感染 MCF-7 细胞 * 半定量 RT-PCR 的方法探讨重组逆转录病毒感染MCF-7 细胞在 Dox不同浓度诱导下自杀基因的表达 * TUNEL分析 图 22 TUNEL法检测逆转录病毒感染 MCF-7 细胞镜下改变（10×40） 1： MCF-7 细胞在 DMEM 完全培养基条件下培养 48 h； 2： 1μg/ml Dox、 2μg/ml GCV作用 48 h 的逆转录病毒感染 MCF-7 细胞； “↑”示凋亡小体。 * BALB/c裸鼠乳腺癌移植瘤模型的建立 * 通过逆病毒直接注射将调控因子 Tet-On 基因及反应元件 TRE 转入到乳腺癌细胞株 MCF-7 裸鼠成瘤模型内，使得裸鼠的体内肿瘤能受到外源诱导剂 Dox 的诱导控制，使自杀基因 HSVtk 转录与表达受到Tet-On 系统的调控，并激活前药 GCV，在体内发挥杀瘤作用。 * BALB/c裸鼠移植瘤的抑瘤实验 * BALB/c裸鼠移植瘤的抑瘤实验 A：DMEM 组； B：GCV+Dox 组； C：GCV+病毒组； D：Dox+GCV+病毒组 * BALB/c裸鼠移植瘤治疗结束后湿重 * M: 100 bp Marker； 1： DMEM 组荷瘤裸鼠肿瘤； 2： GCV+Dox 组荷瘤裸鼠肿瘤； 3： GCV+病毒组荷瘤裸鼠肿瘤； 4： Dox+GCV+病毒组荷瘤裸鼠肿瘤 RT-PCR 检测 BALB/c 荷瘤裸鼠治疗35天后肿瘤 HSVtk 的表达 * BALB/c裸鼠移植瘤的病理形态学检测 A B D A：DMEM 组；