常用分子生物学试剂的选择-中文-.pptVIP

常用分子生物学试剂的选择 赵秋伟 限制性核酸内切酶 II 型限制性核酸内切酶的基本特性 星号活性 在非标准反应条件下,也能切割一些与其特异识别序列类似的序列。在酶的名称右上角加一个星号(*)表示,如EcoRⅠ*。 必须采用规范的实验步骤,坚持应用推荐的反应条件。 DNA连接酶 谢谢！ 修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键 修复与RNA链结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键 连接多个平头双链DNA分子 还可作用于 RNA,但效率低得多,需ATP作辅因子。 应用范围与产品特性 价格￥ 规格 厂商及货号 产品名称 120 25,000units Takara D2011A 　 1,209 500units Promega M1804 312 100units Promega M1801 　 1,248 500units Promega M1794 3,024 100,000units NEB M0202T High concentration at 2,000,000 unitsnits/ml 756 20000units NEB M0202M 3,024 100,000unitsnits NEB M0202L 　 756 20000unitsnits NEB M0202S 400,000 unitsnits/ml 335 10,000unitsnits NEB M0202V 　 158 200units MBI EL0015 6,740 4×500单位 Invitrogen 15224-090 T4 DNA Ligase HI CONC. 1,210 250单位 Invitrogen 15224-041 2,090 500单位 Invitrogen 15224-025 　 610 100unitsnits Invitrogen 15224-017 T4 DNA 连接酶 DNA连接酶 E.coli DNA ligase 作用于5’端带磷酸基团的DNA底物 NAD+可促进该催化反应 分子克隆使用不多，亦不能连接RNA。 用途: cDNA第二链合成。 应用范围与产品特性 价格￥ 规格 厂商及货号 产品名称 　 150 1,000unitsnits Takara D2160A 2,544 1,000unitsnits NEB M0205L 　 636 200unitsnits NEB M0205S 280 100unitsnits NEB M0205V 　 420 100unitsnits Invitrogen 18052-019 E. coli DNA 连接酶 DNA连接酶 * 用于分子克隆的工具酶 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶 DNA连接酶 核酸酶 核酸修饰酶 如何选择最合适的限制性内切酶 限制性核酸内切酶的生物功能 影响限制性核酸内切酶活性的因素 限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶的生物功能 主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵 识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链 细菌的限制与修饰作用 hsd R：编码限制性核酸内切酶 hsd M：编码限制性甲基化酶 hsd S：编码限制性酶和甲基化酶的协同表达 主要特性 I 型 II 型 III 型 限制修饰 蛋白结构 辅助因子 识别序列 切割位点 异源三聚体 多功能 同源二聚体 异源二聚体 距识别序列1kb处 随机性切割 旋转对称序列 TGAN8TGCT AACN6GTGC 距识别序列下游 24-26bp处 识别序列内或附近 特异性切割 GAGCC 限制性核酸内切酶的类型 限制性核酸内切酶 单功能 双功能 ATP Mg2+ SAM Mg2+ ATP Mg2+ SAM 限制性核酸内切酶的命名 限制性核酸内切酶 属名 种名 株名 Haemophilunitss influnitsenzae d 嗜血流感杆菌d株 H i n d III 同一菌株中含多个不同的限制性核酸内切酶,表示在该菌株中发现这种酶的先后次序。 识别双链DNA分子中4 - 8对碱基的特定序列 大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧 识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构 EcoR I的切割位点 EcoR I的识别序列 5’ … G C T G A A T T C G A G … 3’ 3’ … C G A C T T A A G C T C … 5’ EcoRI等产生的5’粘性末端 5’ … G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G … 3’ 3’ … C-G-A