利用农杆菌介导法将PTA和反义Wx双基因导入水稻的研究-作物遗传育种专业论文.docxVIP

附件论文独创性声明 附件 论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取 得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包 含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学 或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所 做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 f，、 研究生签名： Y f 讲年／月中日 0 I 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业 大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 一躲钕己千研究生签名： b＼ 。 I “年钿∥日 导师签名 锄可哞莎月矽El 中文摘要水稻(OryzasativaL。)是中国重要的粮食作物之一，其中有50％以上的人口以其为主 中文摘要 水稻(OryzasativaL。)是中国重要的粮食作物之一，其中有50％以上的人口以其为主 要食粮。水稻在生长发育过程中，不断受到生物因素的威胁和影响。其中叶蝉、飞虱和水 稻蚜虫等吸取汁液的刺吸式口器害虫不仅直接为害，还传播病毒病，严重影响水稻的高产 和稳产。在生产上利用抗虫品种是最经济有效的方法之一，但受到种质资源的限制，传统 育种手段在这方面很难有所突破。近10年来生物技术的飞速发展和基因工程的新进展， 为创造抗性新资源提供了重要手段。已有研究表明：一些植物凝集素对叶蝉、飞虱、蚜虫 等刺吸式口器的害虫有明显的抑制或致死作用。其中在转入了雪花莲外源凝集素基因的棉 花和水稻中，其抗虫效果十分明显。因此，在作物抗虫育种中研究和开发植物凝集素就越 来越受到人们的重视。天南星科半夏属的三叶半夏为中国特有的中草药，它能凝集多种动 物的血红细胞，是一种具有重要应用潜力的凝集素。对其进行生物学抗虫鉴定的研究表明： 从其中提取出来的储藏蛋白对桃蚜和棉蚜具有显著的抗虫活性，这种抗虫活性非常类似于 GNA。张红宇等将PTA基因转入水稻，结果表明其纯系植株对褐飞虱的存活率和发育进度 均有显著的抑制作用。 同时随着生活水平的提高和科学技术的进步，人们对稻米食用品质的要求也越来越 高。稻米食用品质在很大程度上与稻米胚乳中淀粉的组成，即直链淀粉与支链淀粉的比例 有关。稻米中直链淀粉含量高，食味品质差。因而水稻胚乳中直链淀粉的含量在决定稻米 食用品质与蒸煮加工品质上超着重要作用，是稻米品质改良的一个重要指标。水稻胚乳中 直链淀粉的合成是由蜡质基因(waxy)编码的结合在淀粉粒上的淀粉合成酶(GBSS)控制， 而且该基因还控制水稻花粉和胚囊中直链淀粉的合成，是一个组织和发育特异表达的基 因。随着分子生物学技术的发展，水稻蜡质基因(waxy)已被分离和克隆。这就可以通过 对waxy基因的遗传操作来控制水稻中直链淀粉的合成，从而改变其在胚乳中的相对含量， 达到改良稻米淀粉品质和食用品质的目的。本实验结合根癌农杆菌转化法，将构建于同一 载体上的水稻反义蜡质基因(WaxyAntisense)和半夏凝集素基因(PTA)导入水稻，希望 利用反义蜡质基因的干扰，降低蜡质基因的表达量，从而下调稻米胚乳中直链淀粉合量的 同时也提高水稻的抗虫性。这为同时改良水稻多个性状提供了一种新的途径。本实验主要 获得了以下研究结果： 1．分别以不同材料的幼胚作为遗传转化受体，获得了～批转水稻反义蜡质基因(Waxy Antisense)和半夏凝集素基因(朋爿)的潮霉素抗性植株。 2．对潮霉素抗性植株的PCR检测结果表明大多数抗性檀株其选择标{己基因与外源目的 基因共整合，少数植株只整合了选择标记基因和其中的一个目的基因，还有的个别植株只 整合进了选择标记基因而无目的基因。 整合进了选择标记基因而无目的基因。 3．对随机抽取的PCR检测双阳性植株进行Southern blotting杂交检测分析表明：水 稻反义蜡质基因和半夏凝集素基因均已整合到转基因水稻的基因组中，且目的基因基本上 都是以低拷贝的方式整入。 4．对PTA基因进行RT-PCR分析，结果表明PTA基因在转录水平上得到了表达。 5．将转基因植株T1代自交种子成熟胚灭菌后接种在加有潮霉素的1／2MS培养基上进行 潮霉素抗性发芽实验，结果表明：随机抽取的10个转基因株系中有9个株系Tl代植株的 自交种子潮霉素抗感分离比符合3：1，遵循孟德尔单基因显性遗传规律。 6．为了检测反义蜡质基因是否确已起到下调水稻胚乳直链淀粉含量的作用，随机抽取 各阳性独立转化株(以中花9号和日本晴为例)按农业部颁布的简化法进行Tl代成熟种子 胚乳中直