利用转录激活因子样效应物核酶靶向FLT3受体近膜区的效应及机制研究-内科学专业论文.docxVIP

华中科技大学博士学位论文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 PAGE 10万方数据 PAGE 10 万方数据 第一部分 利用基因组编辑技术快速建立基因敲除模型和同源疾病模型 【摘要】 目的 恶性血液病通常由多种复杂的染色体畸变或基因突变引起，单一突变的所致的 生物学效应常常湮没与复杂的基因背景中。基因组编辑工具的丰富和快速发展使得在 较短时间内，在多种生物学系统中，定点敲入或敲除预先设计好的 DNA 序列变得更 为简单。在特定基因背景下通过转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）精确地修 饰单个基因，建立背景完全可以对照的同源细胞系克隆，能够快速建立同源疾病模型， 对于研究特定基因突变对于疾病的发生发展的作用和研发新的治疗手段具有重要意 义。 方法 在本研究中，我们针对人 FLT3、SF3B1 基因和斑马鱼 Sema4d 基因，挑选合适 靶点并设计多对 TALENs 序列，利用改进后的快速构建 TALENs 技术，合成并测序 鉴定针对上述三个靶点的人工核酸酶。克隆原代标本的 FLT3-ITD 突变和定点突变 SF3B1 K700E 点突变构建同源重组所需的供体 DNA 模板（包含或不包含 cre-loxp 抗 性筛选标签）并构建 SF3B1 靶点的“信号灯”双荧光蛋白报告富集系统。然后利用核转 染方式将 TALENs 或模板质粒导入 K562 靶细胞系中。通过细胞亚克隆化及 PCR 方 法鉴定 FLT3 基因敲除克隆。通过抗生素筛选，CRE 重组酶处理和 PCR 鉴定 FLT3-ITD 敲入克隆。利用流式分选通过双荧光蛋白报告系统富集 SF3B1 敲入克隆并克隆化鉴 定。在斑马鱼系统中，将体外转录的 TALENs mRNA 显微注射单胞期受精卵，然后 提取基因组 DNA PCR T 载鉴定。 结果 针对上述三个靶点设计的 TALENs 均显示出在活细胞中对基因组的切割效应， 效率从 3%-26%不等。同时成功获得 K562 细胞系上稳定遗传的 FLT3 单等位基因敲除 的亚克隆多株，FLT3 单等位基因 ITD 敲入亚克隆两株，SF3B1 单等位基因 K700E 敲 入亚克隆两株及对照野生型亚克隆数株。同时成功建立斑马鱼 F0 代 Sema4d 嵌合体 模型。 结论 TALENs 作为一种可定制的、构建简便、效率稳定且能在多种生物学系统中进 行基因组编辑的工具，结合供体 DNA 模板和/或“信号灯”双荧光蛋白报告富集系统， 能够在较短周期内建立同源细胞系疾病模型和斑马鱼嵌合体敲除模型，为后续基因突 变的致病机制、生物学效应和治疗手段研究提供优良的平台。 【关键词】 基因组编辑 转录激活因子样效应物核酸酶 同源疾病模型 Rapid generation of gene knock-out or isogenic disease model using genome editing Abstract Objective: Hematologic malignancies are often caused by multiple complex chromosomal aberrations and/or gene mutations. Biological effects caused by a single mutation are often veiled by complicated genetic background. The rapid development of genome editing tools enables convenient targeted knock-in or knock-out of predesigned DNA sequences in multiple biological systems within a short period of time. Thus rapid generation of isogenic cellular disease models, with completely controllable genetic background by precise genome modification with TALENs, provides great value to the study of mutation related pathogenesis and the development of new therapeutics. Methods: In this study, appropriate target site and multiple TALENs were designed against human FLT3