山东主栽果树AFLP指纹图谱的构建-果树学专业论文.docxVIP

中文摘要本研究选用苹果(Maluspumila 中文摘要 本研究选用苹果(Maluspumila Mill．)、梨(_尸妒US．L)、桃(JP persica Batch) 和枣(Ziziphusjujube Mill．)4种山东主栽果树共53个品种作为试材，应用ALFP (Amplified Fragment Length Polymorphism，扩增片段长度多态性)技术构建了 这4个树种的DNA指纹图谱，并应用其DNA指纹图谱对试材进行了分子水平 鉴定和遗传关系分析。 采取新鲜叶片作为果树基因组DNA的提取材料，采用改良CTAB法提取果 树基因组DNA。其提取液成分为： 3％CTAB，1．4mol几XaC】， 20mmol／LEDTA，lOOmmol／LTriS．HCl(pH8．0)，2％B．巯基乙醇。粗提后DNA经酚／ 氯仿／7异戊醇抽提两次，除去蛋白质，经RNase除去RNA，最后用氯仿／异戊醇除 去多余的RNase，得到了浓度大，基本无降解，蛋白质和RNA去除彻底，纯度高、 质量好的果树基因组DNA。 通过对内切酶用量、酶切时I‘白J、连接时问、稀释倍数等的研究，建立了适于 果树分析的AFLP银染技术体系。在50儿酶切连接体系中，含基因组DNA 200—500 ng，NEB Bufier2 5¨L，BSA0．25pL，EcoRl(20U／gL) 0．25旺，Mse， (1015，79L)O．59L，EcoR，接头(adapter)(5pMol／¨L)1．OgL，?g／se，接头(adapter) (50pMol／laL)1．OlaL，加无菌水ddHj0至50pL，37℃过夜；酶切连接产物进行预 扩增，预扩产物稀释20倍进行选择性扩增，加入79L上样缓冲液(Loading buffer)，95℃变性5 rain，立即冰浴；在6．O％变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分 析，银染法检测PCR产物。 从40对引物组合中筛选出8对引物组合对53个供试品种进行了扩增，初步 构建了节果、梨、桃和枣4种果树的AFLP指纹图谱。通过分析指纹图谱中品种 的特异带，可以将烟富系的6个品系分成2组：烟富1号和2号为一组，烟富3 ；}至6号为一组：可以将供试的21个梨品种和7个枣品种全部区分丌。这体现 出了AFLP在品种鉴定上的高效率，如继续筛选引物组合，可以区分丌供试所有 品种。 根据构建的DNA指纹图谱，采用NTSYS软件计算简单匹配系数(Sm)， 进行分析，建立了节果和桃2种果树品种的聚类分析树状图，分析了这2个树种 的遗传多样性，初步揭示了树种内品种间的亲缘关系，为品种鉴定、种质资源保 存及育种亲本选配，提供了理论依据。 关键词： 果树；AFLP；DNA指纹图谱；聚类分析：品种鉴定 AbstractFifty—three Abstract Fifty—three varieties belong to four kind of fruit trees mainly cultivated in Shandong including apple(Malus pumila Mill．)，pear(聊n L)，peach(P pel sica Batch)and jujube(Ziziphusjujube Mill．)，were used in this experiment．The DNA fingerprinting ofthese fifty three varieties were established by using AFLP technology The identification of these fifty three varieties，and the hereditary relations analysis were also made based on their DNA fingerprinting． The genomic DNA of these experiment materials were extracted by modified CTAB method．The components of modified isolation buffer are：3％CTAB． 1．4mol／L NaCl，20mmol／L EDTA，100mmol／L Tri S．HCI(pH8．0)，2％p—Mercaptoethanal The genomic DNA was purified by phenol／chloroform／isoamyl alcohol(twice)，and the RNA is eliminated from the solution with RNase．finally the g