第三章--免疫组化.pptVIP

7. 漂洗。 8. 复染。 9. 漂洗。 10. 脱水、透明、封片。 11. 光镜观察、记录、显微照片。 （一）免疫荧光组织/细胞化学技术 (immunofluorescence histo/cytochemistry) 由Coons 创立于1941年 1. 原理： 采用荧光素标记二抗，经过免疫反应, 利用荧光显微镜观察标本。 2. 过程/步骤： （1）切片（冰冻切片，石蜡切片脱蜡。 用冷＜4℃ PBS漂洗3次×5`）。 （2）滴加1抗，温室内，37 ℃ ，30 ` （3）冷PBS漂洗3次×5`。 （4）滴加标有荧光素的2抗，湿室，室温 30`或4℃ 过液。 （5）冷PBS漂洗3次×5`。 （6）荧光显微镜观察及摄片/封固后观察。 注意事项: ①PH值，接近抗体环境为佳。 ②加二抗之前，将二抗离心去除沉淀物 ③注意切片是否放平，保证抗体覆盖标本 ④反应中，标本一定保持在一定的湿度内进行，从而防止标本变干。 ⑤温度一般在37℃或室温内进行，如果待查抗原耐热能力差，可在4 ℃下进行，但要延长作用时间。 ⑥漂洗一定要干净。 ⑦切片不干时，就观察或封固。 ⑧同时设对照染色，用正常血清代替荧光体，结果为阴性。 （二）免疫酶标组织/细胞化学技术 (horseradish peroxidase labelled histo/cytochmistry method) 1. 原理： 在二抗上标记HRP。 2. 步骤：同基本步骤 （三）过氧化物酶一抗过氧化物酶法 (peroxidas-antiperoxidas complex method) : PAP法。 1. 原理： 2. 步骤：同基本步骤,不同的PAP复合物。 3. PAP法的特点： ①抗体活性高： ②灵敏度高： ③背景染色浅，有利于观察和记录。 ④问题： 4. 注意事项： （四）抗生物素—生物素复合技术 （avdin-biotin-peroxidase complex method，ABC） 1.原理：ABC 法由Hsu建立于1981年。 生物素： 抗生物素： 2.步骤：同基本步骤,不同的ABC复合物。 3.优点： ①敏感性强。 ②特异性强，背景染色浅。 ③方法简单，节约时间。 ④ABC试剂盒国内已大量生产，价 格 适中。 ⑤生物素具有与多种显示剂结合的 能力，可用作双重或多重免疫染色。 4. 注意事项： LAB法：标记亲和素-生物素法 ABC法：亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法 * 免疫组织化学技术 (immunohistochemistry) 一、定义及其发展： 免疫组织/细胞化学(immunohisyo/cyto- chemisty)是组织化学技术的分支，它是用已知并标记的特异性抗体（抗原）对组织（细胞）内的抗原（抗体）的存在及分布进行组织原位的定性或定量显示。原位免疫学(in situ immunology) 其特点： 高度特异性 高度敏感性 方法和过程统一 形态、机能、新陈代谢等生命活动相结 合。 因此免疫组织（细胞）化学技术已被 广泛用于生命科学的研究。 Coons及同事们于1941年首次用荧光素标记抗体检测肺炎双球菌获得