基因组学一．重组质粒的转化筛选和鉴定操作目的1学习克隆.docVIP

基因组学 一．重组质粒的转化、筛选和鉴定操作 实验目的：? 1、学习克隆工作中最常用的双酶切；? 2、学习将外源基因与质粒连接方法及操作技术；? 3、学习氯化钙法制备 大肠杆菌 感受态细胞的技术；? 4、了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义.? 5、外源质粒 DNA 转入受体菌细胞的技术以及筛选转化体的技术.? 6、学习鉴定重组子的方法. ? 实验原理：? ? ?? 重组子的建立：采用双酶切 质粒 载体pBR322和pUC18,酶切后产生了互补的粘性末端,在T4 DNA 连接酶的作用下,两个质粒片段连接.? ? ?? 感受态细胞(Competent cells)：受体细胞经过一些特殊方法(如：CaCl,RuCl等化学试剂法)的处理后, 细胞膜 的通透性发生变化,成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) .? ? ?? 转化(transformation)：是将异源DNA分子引入一 细胞株 系,使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段,是基因工程等研究领域的基本实验技术.? ? ?? 电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞,通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞.? ? ?? 克隆的筛选：主要用不同 抗生素 基因筛选.常用的 抗生素 有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等；? ? ?? 重组质粒克隆的鉴定：鉴定带有重组质粒克隆的方法常用的有α-互补、小规模制备质粒DNA进行酶切分析、插入失活、PCR以及杂交筛选的方法.最常用的方法是小规模制备质粒DNA进行酶切分析,对于带有LacZ基因的载体还可以结合α-互补现象来筛选. ? 试剂与器材：? 1、试剂：pUC18质粒,pBR322质粒,DL2000 Marker, Pst I(15U/ul)及酶切缓冲液, EcoR I(15U/ul)及酶切缓冲液,DNA Ligation Kit Ver 2.1 (TaKaRa),LB液体培养基(Luria-Bertani) ,LB固体培养基,50mg/ml卡那霉素(kanamycin)储存液,质粒快速提取试剂盒(博大泰克),10 X Buffer K, Pst I,EcoR I (TaKaRa)? 2、器材：电基因转移议,恒温摇床,台式高速离心机,恒温水浴锅, 琼脂糖凝胶电泳装置,电热恒温 培养箱 ,电泳仪,超净工作台, 微量移液枪,eppendorf管. ? 操作方法：? 1、构建重组质粒? ? ?? 质粒pUC18和pBR322分别用Pst I和EcoR I双酶切,将酶切产物按照1：1的比例混合,使用T4 DNA连接酶连接,构建成重组质粒.? 2、制备感受态大肠杆菌细胞? ? ?? 收集大肠杆菌细胞,采用CaCl2处理,制备成 感受态细胞 .? 3、重组子的转化? ? ?? 将构建的重组质粒加入到制备的感受态细胞悬浮液中,电击法将重组质粒转化到宿主细胞中.? 4、重组子的筛选鉴定? ? ?? 采用蓝白筛选重组子.酚/氯仿快速抽提质粒,酶切后 电泳 鉴定. 关键步骤与注意事项：? 1、连接反应温度选择要适中,过高粘末端之间形成氢键不稳定,过低会影响 连接酶 的活性.? 2、连接反应两种质粒的比例为1：1,否则容易自连.? 3、制备感受态细胞时要采用对数生长期初期的细胞,低温处理时间要足够.? 4、电击法时电击电压、电流、时间选择要合适.? 5、转化及蓝白筛选要作阴、阳性对照,防止出现假阳性、假阴性. 二．病毒RNA传统提取方法 细胞的裂解 1、单层细胞的裂解 a）吸出培养液，以7ml用冰预冷的无钙镁离子磷酸缓冲盐溶液PBS冲洗细胞培养皿内的单层细胞，重复1次，将平板置于冰上直至所有单层细胞冲洗完毕。也可将平板放在一块铝板上，再将铝板置于冰盘上。 b）直径为90mm的培养皿需加0.5ml RNA提取缓冲液，并使之遍布整个平板的表面。（RNA提取缓冲注液配方：0.14mol/L NaCl，1.5mmol/L MgCl2，10mmol/L Tris.Cl(pH8.6)，0.5％NP-40，1mmol/L二硫苏糖醇（DTT），100单位/ml RNA酶抑制剂或20mmol/L氧钒核糖核苷复合物。） c）加0.5ml蛋白酶消化缓冲液，用刮棒混匀粘稠状裂解物并将其刮到平板的边缘。（蛋白酶消化缓冲液配方：0.2mol/L Tris.Cl(pH8.0)，25mmol/L EDTA(pH8.0)，0.3mol/L NaCl，2％ SDS） d）用装有21号针头的皮下注射器抽吸细胞裂解物，再将其注入聚丙烯管内。重复3－4次，剪切DNA。 e）加蛋白酶K至终浓度为200μg/ml，充分混匀后置于37℃温育30分钟。蛋白酶K以贮存液的形式保存，贮存液为20mg/ml蛋白K溶液。 2、悬浮培养