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分子生物学实验的常见问题与解决方案-1一、Southern杂交 东华理工大学分子微生物实验室 核工楼413 郭勤总结 参考胡老师博客 ////0. 分子生物学实验的常见问题与解决方案-1 一、Southern 杂交 问题 1 : 电 泳后发现凝胶中DNA 扩散, 导致结果难以确定, 如何解决这一问题? 解决方案: (1)在操作上:电泳时隔孔上样,电泳后要对凝胶及时处理使凝胶 干燥;(2)琼脂糖的质量应该较好,尤其是不应含有内切酶,否则有时将使低 拷贝数基因的杂交结果难以解释。 问题 2 : 传 统方法中转膜不完全的问题如何克服? 解决方案: 经典的向上转移法会使凝胶短时间内变薄,此时即使延长转移时间至 24 小时以上,也不能使大分子DNA 良好地转移出去,因此,转膜不完全。 向下转膜 法由于不需在吸水纸上增加重量,凝胶基本不变形;加之吸水纸的吸力与水受到 的重力方向一致,故可以良好地完成DNA 的转移,它不需要特殊的仪器,转移速度 较快,转移效率高。 利用地高辛标记探针进行 Southern 杂交时, 对于大于15kb 的 DNA 片断, 转膜 之前用盐酸进行脱嘌呤可以促进转膜效率, 但脱嘌呤过度可导致分子量相对较 小的 DNA 被打断成过小的片段而难以和尼龙膜结合。如果实验转膜过程中同时 含有大于 15kb 的DNA通常为基因组和小片段DNA通常是基因组酶切产物, 那么在转移的过程中倾斜容器, 仅使凝胶上半部分浸泡于盐酸, 这样既可以提高 大片断 DNA 的转移效率,又不会打碎小片段DNA。 另外, 等采用琼指糖凝胶直接杂交的方法, 来解决这一难题: 以转基因鼠的检测 为例,实验步骤如下:1.转基因鼠的建立:以鼠乳清酸蛋白WAP基因5’调控 区指导人G-CSF 基因为构件, 建立转基因小鼠。 转基因小鼠的检测采用剪取鼠尾 DNA 做Southern 进行鉴定。2.琼脂糖凝胶直接杂交:l用BanHI150U对由假孕 鼠产生的仔鼠剪尾提取基因组DNA10μg 酶切过液, 取少量电泳检查酶切完全后, 上样电泳8 小时,2将电泳槽板连同凝胶置50℃放置3 小时, 用镊子轻轻揭起 凝胶,放于变性液0.5MNaOH,0.5MNaCl20 分钟,转置中和液0.5MTrisHCl, 0.15MNaCl20 分钟,将胶放于玻璃板上沥干液体,室温放置30 分钟。3干胶 应立即杂交。先将胶在水中泡一下,以利于操作。4将胶放人杂交液6×SSC、 5×Denhardt’S、 0.25% SDS、100μg/ml 鲑鱼精DNA, 加人探针,42℃杂交16-20东华理工大学分子微生物实验室 核工楼413 郭勤总结 参考胡老师博客 ////. 小时。5杂交完成后, 洗膜 8 轮,42℃每次15 分钟。2×SSC、0.1%SDS、1×SSC 、 0.1SDS、0.1×SSC、0.1%SDS、0.1×SSC、0.1%SDS、 各洗两次, 在冰水中浸泡 2 分钟,以利于盐的排出。6干燥后按检测试剂盒操作,室温压片0.5-2 小时。 冲片照相。 使用的探针为G-CSF。DNA, 探针标记采用Fluorescein-12-dUTP,检 测试剂盒为杜邦公司产品, 操作按试剂盒说明书进行。 用琼脂糖凝胶直接杂交的 方法, 较好地解决了微量核酸或低拷贝数转基因的检测问题, 结果不仅直观, 而 且特异性好。 与常规的Southern 杂交相比, 它所具有的优势是, 它省略了将DNA 进行转膜的步骤, 从而避免了因转膜不完全所造成的DNA 量的损失, 特别是低拷 贝数基因的丢失。另一方面,也使复杂的Southern 杂交操作程序大大简化。因 此, 在转基因鼠的鉴定中以及微量核酸检测、 疾病诊断中是防止低拷贝数基因漏 检的一种可行途径。 问题 3 : 在 向下转膜法中,如何提高转膜效率? 解决方案:1、转移液的水平面应略低于凝胶的水平面。如果转移液的水平面高 于凝胶, 短时间内会有大量液体聚集在凝胶上, 直接从侧面流失; 果转移液的水 平面过分低于凝胶,影响纱布的吸水力,转移效率下降。2、吸水纸吸水后易变 形, 使吸水纸与滤纸间产生空隙, 而降低吸水纸的吸水效率, 应及时更换吸水纸。 3、 过夜转移时, 及时添加转移液, 防吸干。4、 样本丰度高时, 移时间可以缩短 至1 小时, 此时凝胶上仍可见大分子量DNA 的残留, 当样本丰度低时, 以延长转 移时间。5、纱布上不要加盖重物,防凝胶受压变薄,响转移效率。 问题 4 碱转移结束后的尼龙膜潮湿不利于保存, 且防止长期保存过程中DNA 结合 不紧密影响杂交效果,应如何做? 解决方案: 将尼龙膜置于滤纸上干燥片刻, 在紫外交联仪中将转有DNA 的