细胞培养流程以B16细胞为例.docVIP

B16细胞培养流程 细胞培养所需器材和药品：15毫升的离心管，枪（lOOOul）,培养瓶，离心机，PBS，培养基，一次性吸管，冻存液，冻存盒，冻存管（1500iil）。细胞复苏流程 首先，在超净台中将两支吸管，一个培养瓶，和两只十五毫升 离心管放入，用紫外杀菌半个小时左右。定时半个小时。与此同时， 将盛有培养基的瓶子放入37摄氏度左右的水浴中。 半小时过后，关闭紫外，打开普通照射和弱风，用酒精对手消 毒，进入超净台，对超净台用洒精消毒，之后点燃洒精灯。 取两只离心管用酒精灯火焰对盖口消毒后，打开盖子，再烧一次瓶口 和瓶盖，将去盖的离心管放在离心管架上，将一只消毒的吸管放入其 中一个离心管中。在水浴中取出培养基的瓶子，酒精消毒后放入超净 台，撕去胶条，烧盖口，打开后再次烧盖子和瓶口。取第二只吸管吸 取2毫升培养基放入打开盖的无吸管的离心管中，将吸管放入盛有培 养基的瓶子中。 在液氮中取出冻存的细胞，放入水浴，直到冻存管中剩余一小 块冰时拿出，酒精消毒后用另一只吸管放入己加入培养基的离心管 中，吸管用后仍放在无培养基的离心管中。将有细胞的离心管烧口和 盖后，拧紧盖子再次烧盖门，拿出超净台，取含有同体积液体的离心 管与含有细胞的离心管对着放入离心机中，定时3分钟。 时间到了之后，取出含细胞的离心管，酒精消毒后放入超净台， 烧盖口后打开，再次分开烧口和盖子，然后用第一只吸管排尽空气后 吸取上清液放入废液缸中，吸管放入之前的离心管中。用培养基中的 吸管吸取培养基放入只剩细胞的离心管中，用同一只吸管吹打，将细 胞吹散。 将空的培养瓶用火焰按上述方法消毒后，用吸培养基的吸管将 细胞液放入培养瓶中，注意吸管口不能碰到瓶口也不能进入瓶口，注 入细胞液后若培养基少可再去新的吸管加入适量培养基，若不少则不 必再加。将培养瓶平放，水平方向轻晃几下，用火焰对口和盖消毒 后盖上盖子，再次烧口和盖。拿出超净台在显微镜下观察一下，最后 迅速放入培养箱中，放入培养箱后将瓶口松开一圈，迅速关紧培养箱 的门 整理超净台，将培养基的瓶子火焰消毒后用胶条封U，其余用 过的离心管和吸管扔掉，熄灭酒精灯，用酒精再次对超净台消毒，关 上超净台的门后关闭超净台的电源。 细胞换液流程（在上次换液或者复苏24后） 将三支吸管和两只离心管放入超净台进行30分钟的紫外照射，同 时将PBS和盛存培养基的试剂瓶放入37摄氏度水浴中。 30分钟过后，关掉紫外照射，打幵弱风和普通照射，对手酒精消 毒后进入超净台，对超净台进行酒精消毒，点燃酒精灯，对两只 离心管烧门打开再烧门和盖后放在离心管架上。 从水浴中取出PBS和培养基试剂瓶消毒后放入超净台，撕去胶条， 烧口后打开，再次烧口和盖子，取一只干净的吸管放入培养基试 剂瓶中，另一支吸管放入PBS试剂瓶。 从培养箱中取出细胞（手进入培养箱前消毒，进入培养基后迅速 拧紧培养瓶的盖子，迅速拿出），迅速关上箱门。对培养瓶消毒后 拿进超浄台，烧口后打开，再次烧口和盖，将培养瓶倾斜使旧的 培养基集中在一个角上，用第三支吸管吸出旧的培养基，加入PBS 清洗（可以将培养瓶平放，轻晃，使清洗更全面），清洗后用同一 支吸管将PBS吸出，加入新的培养基后，将培养瓶放平，使培养 基完全浸泡细胞，烧口和盖，封盖，再次烧口后将培养瓶放入培 养箱，放入前可以在显微镜下观察一下，放入时的注意事项与复 苏后放入培养箱时一样。 对手消毒后进入超净台，收拾超净台，将PBS和培养基经过烧口 和盖后盖上，再次火焰杀菌后用胶条封口，拿出后放入冰箱冷藏 室（2—8摄氏度），将用过的离心管和吸管放入固体废弃缸，拿出 超净台，熄灭酒精灯，再次对超净台酒精消毒后关闭超净台的门， 关掉电源 传代流程 准备三只吸管，儿个培养瓶，三只离心管，至于超净台中，紫外 灭菌30分钟左右。定时30分钟。同时将培养基和PBS放入37 摄氏度的水浴，将胰蛋白酶放在室温环境中解冻。 30分钟过后，手用酒精消毒后，从培养箱中迅速取出需要传代的 细胞（取出前注意迅速拧紧瓶盖），在显微镜下观察一下，酒精消 毒后放入超净台。将三支离心管烧U打开，分别标注后放在离心 管架上。 取一支吸管插在培养基试剂瓶中，一支放在PBS试剂瓶中。将存 细胞的培养瓶烧口，打幵，再次烧口和盖，将旧液一次性倒入废 液缸，用吸管吸取PBS进行清洗，用吸管吸取PBS在细胞层上淋 洗，淋洗后的吸管插在一支离心管中，用作废液吸取。淋洗后将 培养瓶中的PBS倒掉。 用lOOOul的枪吸取1毫升的胰蛋白酶液注入细胞培养瓶中，水平 轻晃几下，将瓶子烧口和盖，盖上后再次烧口，放入培养箱中（也 可以水平放在超净台上），两分钟过后拿到显微镜下，看到大部分 细胞开始变圆或者突起浮起来，洒精对瓶子外边消毒后迅速拿进 超净台，烧口打开，再次烧口，吸取2—4毫升培养基注