第22章免疫学检测技术教学课件.ppt

* 2. 免疫荧光法** （immunofluorescence assay, IFA） 是用荧光素与抗体连接成荧光抗体，再与待测抗原反应，置荧光显微镜下观察，抗原抗体复合物散发荧光，借此对标本中的抗原作鉴定和定位。 常用荧光素： 异硫氰酸荧光素（FITC）：发黄绿色荧光 藻红蛋白（PE）：发红色荧光 直接免疫荧光与间接免疫荧光 激光共聚焦显微检测+IFA 3. 免疫印迹技术(WESTERN BLOTTING) 4. 放射免疫测定 （RADIOIMMUNOASSAY, RIA） 放射性核素标记抗原或抗体 优点：高度的灵敏性，可进行超微量分析 缺点：有放射性危害 5. 化学发光免疫分析（CHEMILUMINESCENCE IMMUNOASAY, CLIA） 化学发光物质标记抗原或抗体：吖啶酯或鲁米诺 灵敏性高，操作简便 luminol + hydrogen peroxide → 3-APA[?] → 3-APA + light 6. 免疫胶体金技术 （IMMUNOGOLD LABELING TECHNIQUE） 胶体金颗粒标记抗原或抗体 广泛用于快速检测试剂盒（HBsAg, HCG等） 已结合有Ag 已结合有抗抗体 7. 蛋白质芯片技术 （抗原芯片、 抗体芯片） 8. 免疫PCR （IMMUNO-PCR） PCR：聚合酶链式反应，polymerase chain reaction DNA分子标记 外周血单个核细胞的分离 T、B淋巴细胞的分离 淋巴细胞功能的检测 第二节 免疫细胞检测 一、外周血单个核细胞（PBMC）的分离** 葡聚糖-泛影葡胺（淋巴细胞分离液）密度梯度离心法分离PBMC 二、淋巴细胞及其亚群的分离 （一）免疫吸附分离法(淘选法) 将已知针对细胞表面标志的抗体包被培养皿,加入淋巴细胞悬液,表达相应表面标记的细胞即与相应抗体结合,而贴附于固相载体上从而与悬液中的其他细胞分开. 利用表面标志分离淋巴细胞（淘选法） （二）免疫磁珠法 （immune magnetic bead,IBM） 将已知抗细胞表面标志的抗体交联于磁性微珠（平均直径1.5μm),即成为免疫磁珠,将其与细胞悬液反应后,磁珠借抗体结合于相应细胞群或细胞亚群表面.再将细胞悬液加于一试管内并置磁场中,因免疫磁珠被磁场吸引,就可将免疫磁珠结合的细胞与未结合的细胞分离开来。如借此可分离获得高纯度的淋巴细胞. 阳性分离法 阴性分离法 MACS微珠进行磁性标记 未标记的细胞先行流出 洗脱阳性分选的细胞 免疫磁珠分离(IMB): 淋巴细胞亚群 （三）荧光激活细胞分离仪分离法(FACS) 又称流式细胞术(flow cytometry, FCM） 集光学、流体力学、电力学、计算机技术于一体，可对细胞进行多参数定量测定和综合分析，并可进行分选。 速度快、精度高、准确性好 （四）抗原肽-MHC分子四聚体技术 原理:用生物素化的抗原肽-MHC I类分子复合物与荧 光标记的亲和素（抗生物素蛋白）结合,由于1个荧 光素标记的亲合素可结合4个生物素分子,能使4个 抗原肽-MHC I类分子复合物形成一个复合体,将该复 合体标记荧光素后,即成抗原特异性四聚体.该四聚 体能与样品中的特异性T细胞的TCR结合,由于四 聚体能同时结合一个T细胞表面的4个TCR,亲和 力大大提高. 应用: 可鉴定表达抗原特异性TCR的T细胞亚群 ** 抗原肽－MHC分子四聚体技术 三、免疫细胞功能的测定 （一）T细胞功能测定 1. T细胞增殖试验 PHA、ConA等丝裂原以及抗CD3单克隆抗体等能非特异地活化培养的T细胞使其淋巴母细胞化，并使其增殖。在此过程中，细胞DNA、RNA、蛋白质的合成增加，细胞形态改变，最终细胞分裂。 形态计数法 形态改变 [3H]-TdR掺入法 DNA复制 MTT比色法 代谢增强 迟发型（IV型）超敏反应（DTH）的检测 ——皮试法，用于检测T细胞的功能 原理：外来抗原刺激机体后，再用相同的抗原做皮试。 阳性反应：皮试的24~72小时出现局部红肿硬结（效应T细胞与特异性抗原结合作用后，引起的以单核细胞浸润和组织损伤为主要特征的炎症反应） （二）细胞毒试验 检测CTL、NK等杀伤靶细胞活性 方法： 51Cr释放法： 金标准， 51Cr与胞内蛋白稳定结合 乳酸脱氢酶（LDH）释放法 ： 正常细胞不会释放LDH 细胞凋亡检测 ** 形态学检测法 琼脂糖凝胶电泳法 TUNEL法 流式细胞术（FCM） DNA ladders TUNEL aasay （三） B细胞功能测定 血清Ig含量的检测：单向琼脂扩散实验、ELISA、 免疫比浊法检测IgG、IgA、IgM的含量 2.抗体形成细胞测定