crispr cas9进行全基因组地筛选.docVIP

实用标准 文档大全 Human CRISPR Knockout Pooled Library (Brunello) lentiCas9-Blast质粒的基本信息： /pooled-library/broadgpp-human-knockout-brunello/ 由于cas9自待的抗性基因是我们不需要，在抗性基因两边突变出酶切位点，酶切掉原本的抗性基因。换成另一种。 lentiCas9-Blast质粒购买来时是以细菌的形式存在的,先需要扩大培养。 试剂盒提取质粒，并测定浓度。 慢病毒包装质粒 转染前24 h，用胰蛋白酶消化对数生长期的HEK293T细胞，调整细胞为7*105在5ml的DMEM培养基中。37 ℃ 、 5% CO2 培养箱内培养。待细胞密度达70%～80%时即可用于转染。 转染前2 h将细胞培养基更换为无血清培养基。 向离心管中加入质粒DNA和等体积的Opti-MEM，混匀，调整总体积为 2.5 ml，在室温下温育5分钟。 将Lipofectamine 2000试剂轻柔摇匀，取100 μl Lipofectamine 2000试剂在另一管中与2.4 ml Opti-MEM混合，在室温下温育5分钟。 把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine 2000进行混合，轻轻地颠倒混匀，不要振荡。必须在5分钟之内混合。 混合后，在室温下温育20分钟，以便形成DNA与L