筛选阴道正常细菌治疗奶牛慢性子宫内膜炎的研究.pdfVIP

“有抗奶”的危害茫然不知，国家也一直没有出台针对牛奶中抗生素残留量的卫生标准， 以致“有抗奶”仍流通于我国绝大部分城市。目前只有少数几个城市和企业，如北京、上 海、深圳以及“雀巢”等外资企业在收购牛奶时对抗生素残留设限。显然，“有抗奶”已 为人们所重视【10”J。 欧美国家早在40年前就投入大量人力、物力，研究替代抗生素的药物，但这种 既可治疗奶牛乳腺炎、子宫内膜炎，又不会有残留问题的药物。至今尚无明确结果。目 前，人们正在研究更安全的传统中药以及最近二十几年新兴发展起来的微生态制剂作为 替代品。 ． 目的和意义 本研究以微生态理论作为指导，分离奶牛阴道内正常细菌，经体外试验、免疫原性 检测和安全性检测，筛选阴道正常细菌治疗奶牛子宫内膜炎，从而减少抗生素的使用、 药物残留，为临床治疗奶牛子宫内膜炎提供新的手段。 6 2材料和方法 2．1试验材料 2．1．1样品 奶牛慢性子宫内膜炎的内容物 经产健康奶牛阴道壁粘液 2．1．2试验动物 20．229左右昆明系小白鼠来自本校兔场 2公斤左右的健康母兔来自本校兔场 2．1．3培养基 非选择性厌氧细菌培养基BHItl21，初次分离增菌培养基【121，高盐甘露醇琼脂培养基113l， ss琼脂f13】，伊红美兰培养基【’引。血琼脂【13】等。 2．1．4主要仪器 电子天平(AEc-200湘西电子天平制造厂)、微型旋涡混合仪(上海沪西分析仪器 厂)、牛津杯(上海市药品检验所)、温箱、4C冰箱、微量加样板、340rtm测试波长的 分光光度计、定时计、微量加样器等。 2．2试验方法 2，2．1奶牛阴道正常菌群的分离和纯化 2．2．1．1标本采集和预处理 用75％酒精对阴户周围进行消毒后用棉拭予沾取阴道内壁黏液，立即放入试管中 (含有硫乙醇酸钠)。厌氧菌分离标本采集后尽快送往实验室，标本应放在装有硫乙醇 酸钠运送液(加无菌液体石蜡)的带螺旋帽试管内。 标本的分散将标本置于盛有小玻珠和还原运送液的小试管中，后在微型震荡器上震 荡1分钟。 2．2．1．2初代培养 2．2．1．2．1培养基的选择 需氧培养选择初次分离增菌培养基；厌氧培养选择非选择性厌氧细菌培养基BHI， 用前放入无氧环境(厌氧培养罐中)使其预还原24-48小时。 2．2．1．2．2标本接种 每个棉拭子接种2个非选择性血平皿，分别置于有氧和无氧环境中培育，厌氧培养 接种后立即放入厌氧罐内．避免在空气中暴露太久，培育48小时后对平皿进行初次检 查，如生长继续孵育一周。 2．2．1．3二代培养、厌氧菌的确定和耐氧试验 标本接种血平板，48小时孵育后取出，用放大镜观察并记录平皿上各种菌落的形态。 每个平皿至少挑取5个形态不同的菌落，标上1、2、3、4、5号码。涂在载玻片上革兰 氏染色、镜检。然后将平皿分别置于有氧和无氧环境中，经48小时孵育。如待检细菌 在有氧或无氧中均能生长者为兼性厌氧菌。如在有氧环境中不生长，而无氧环境能生长 者，即为专性厌氧菌。 2．2．1．4纯化 挑取单个菌落在同一血平板上划线。直至表观菌落形态一致。 2．2．1．5生理生化试验 采用预成酶法IJ4】：利用待测细菌所产生的预成酶(performed enzyme)在37C与生化试 剂基质产生特异的酶反应，籍敏感的指示系统在4．12小时即可观察到结果。 2．2．1．5．1接种环刮取琼脂表面的菌苔。混悬O．5．1ml的0．2MPBS中，使之成为均匀的浓 菌悬液，与标准细菌浊度比较并调至合适的浓度(约25{乙／ml左右)。 2．2．1。5’2用巴氏吸管吸取上述浓菌液，分别加入反应微量如样板中，每孔I-2演。 2．2．1．5．3取生化基质加入上述微孔中，每孑LI-2滴并与菌液混合，加盖后放置37℃普通 孵箱中4．12小时后取出。 2．2．1．5．4加指示剂观察结果。发酵糖醇产酸用BM指示剂：红色或黄色为+，绿色为．。 Mannal ofDeterminative 2．2。1．6鉴定查第八版伯杰氏细菌鉴定手册(Be曜ey’s