免疫组化技术ppt课件.ppt

Staking gel Separating gel 湿转是一种传统方法，将胶/膜叠层浸入缓冲液槽然后加电压。这是一种有效方法但比较慢，需要大体积缓冲液且只能用一种缓冲液。 转膜 半干转移用浸透缓冲液的多层滤纸代替缓冲液槽。因为电极板直接与滤纸接触，使凝胶中电场强度尽可能大以快速高效转移。与湿转相比，这种方法又快（15-45 分钟）又好。 两种转移系统中都必须注意防止在滤纸、凝胶和膜之间的任何地方存在气泡 小分子量的蛋白半干转效果比较好，大分子量（100KD以上）建议湿转。 根据目的蛋白的分子量决定转膜时间。 半干转移系统中，滤纸和膜切成与凝胶相同大小很重要，这样电流必须通过凝胶。否则，在凝胶边缘处滤纸重叠将导致电流短路。 注意 膜 选择种类 NC PVDF 尼龙膜 选择标准 a.膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）； b.不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法，信噪比好）； c. 后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜 膜的特点 免疫学检测 封闭 一抗、二抗：工作浓度可通过预实验确定。 显色 显色方法 化学显色法 : 方便、便宜、有毒、灵敏度较低、费抗体、反应慢、线性窄、不易保存、不能重新剥离检测 化学发光法 : 灵敏、快速、节省抗体、反应快、线性宽、无害、特异性高、可重新剥离检测 同位素法 : 灵敏度高、不安全、环境污染、不方便和半衰期短 荧光底物法： Krypton ?荧光底物 内参的选择 内参：对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白。 各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性 目的蛋白的灰度值除以内参的灰度值以校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。 常用的蛋白质内参有GAPDH和细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin 结果分析 保证内参照均一的情况下，比较目的条带 R A (一) 灌胶 (二)电泳 (二)电泳 (三)转膜 (三)转膜 (四)免疫学检测 (三)转膜 Western blot应用 用途:用于目的蛋白的定性、半定量、简单定位分析 目的蛋白与其它蛋白的互作 目的蛋白的组织定位 目的蛋白的表达量分析 优点：敏感，可显示蛋白分子量 局限性：不能准确反应蛋白的细胞定位、亚细胞 定位以及多种蛋白之间的相互位置关系 从蛋白水平检测角度，免疫组化技术与Western blotting、ELISA的异同 Western blotting：蛋白质免疫印迹 利用抗体抗原反应原理，结合化学发光等技术来检查组织或细胞样品内蛋白含量的检测方法。 与免疫组化技术相比，定量可能更加准 也可定性和定位（通过提取膜蛋白或核蛋白、胞浆蛋白分别检测其中抗原含量，进而间接反映它们的定位），但敏感性远远低于免疫组化技术。 ELISA：酶联免疫吸附试验 利用抗体-抗原-抗原结合反应原理来检查体液或组织匀浆中蛋白含量的检测。 与免疫组化技术相比，定量最准确，是分泌性蛋白检测首选方法之一。 从蛋白水平检测角度，免疫组化技术与Western blotting、ELISA的异同 谢谢！ THANK YOU SUCCESS * * 可编辑 * 多克隆抗体的产生： 以纯化的抗原免疫动物而获得，实际上是针对多个抗原决定簇的多个抗体组成，检测范围广。常用的多克隆抗体一般在兔身上产生，国外产品目录上常以RaH（rabbit against human）表示。弄清一抗多克隆抗体的动物来源种类对后继抗体的选择至关重要。 单克隆抗体的产生： 应用细胞融合的杂交瘤技术，以针对单一抗原决定簇的小鼠与小鼠骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤，其特点是既能产生特异性抗体，又能在体外无限的增殖。将瘤细胞注入小鼠腹腔内即可获得单克隆抗体，由此产生的小鼠抗人的抗体常以MaH（mouse against human）表示。 * 对照包括阴性对照、阳性对照和自身对照。在实践中可用染色组织切片中不含抗 原的组织作为阴性对照，而用含抗原的正常组织作阳性对照，这种自我对照具有节约的意义。 观察染色结果时，先观察对照组织的结果，如阳性对照组织中阳性细胞 呈强阳性，阴性对照细胞呈阴性，内源酶阴性，背景无非特异性染色时，表明本次实验的全部试剂和全过程技术操作准确无误，待检组织中的阳性细胞也就是可信的 正确结果。 如actin、CD34在正常组织中的血管壁肌层应为阳性，vimentin 可以间质细胞，对照desmin以血管壁及肌束为对照，S-l00蛋白以小神经末梢为对照等， * P