耻垢分枝杆菌基因敲除经验交流课件.ppt

耻垢分枝杆菌基因敲除经验交流 相关质粒说明 一步筛选带标记基因突变株 两步筛选带标记基因突变株 两步筛选无标记基因突变株 敲除过程及原理 其他说明 主要内容 如何阅读质粒图谱？ 第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。 第三步：看多克隆位点（MCS）。 第四步：再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。 第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。 Mycobacterium-Escherichia coli shuttle vector lacZ 作为筛选标记 lacZ基因编码的β一半乳糖苷酶（简称β-gal) 可催化乳糖的水解． β一半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。 有色物质可以使整个培养菌落产生颜色变化，而颜色变化是鉴定和筛选的最直观有效的方法。 -peptide when combined with the carboxyl terminus of b-galactosiase can make a functional b-galactosiase α-complementation 无菌落长出 转化方面的问题，感受态细胞效率低 长出菌落很多，但白色菌落很少 感受态细胞转化效率较高，但连接反应有问题，大多数是载体自连产生的蓝色菌落 长出菌落很少，且白色菌落少 外源片段与载体的量都太少，连接子很少； 外源片段与载体的比例不合适； 连接缓冲液稀释倍数不对； 连接时间不够长； 体系中有抑制因子导致连接失败； 外源片段插入了载体，但没有打破LacZ的阅读框，产生的菌落仍为蓝色。 现象 原因 sacB 作为负筛标记 sacB , 编码蔗糖6-果糖基转移酶 催化蔗糖水解并合成高分子量的果聚糖 在存在10%蔗糖时, sacB 基因的表达对耻垢 分枝杆菌是致死的 其毒性的分子机制还不是很清楚 Pelicic V, Reyrat JM, Gicquel B. Expression of the Bacillus subtilis sacB gene confers sucrose sensitivity on mycobacteria. J Bacteriol 1996;178:1197-9. 构建自杀质粒 构建自杀质粒 不能在分枝杆菌中复制 加入筛选标记 1165 bp 6359 bp 5409 bp pMind-2630UD-sacB digests with Pac I and Spe I 电转化 200 ml 感受态细胞 5-10 ml 质粒(50–500 ng) 0.2 cm 电转杯2.5 kV , 5 ms 37 ℃复苏4 h 涂布相应平板 培养至OD为0.9 (600 nm) (冰浴 1.5 h)，4 ℃ 3,000 rpm离心收集菌体 10%冰浴甘油洗涤两次， 4 ℃ 3,000 rpm 离心 1/20th 原始培养基体积的冰浴 10% 甘油重悬 200 μl分装-80 ℃保存 准备电转化感受态 电转化条件 一次双交换 选择培养基为：7H10+10%蔗糖+50 mg/ml 的潮霉素+X-Gal 一步筛选带标记基因突变株 选择培养基为：7H10+50 mg/ml 卡那霉素 +50 mg/ml 潮霉素+x-Gal 两步筛选带标记基因突变株 第一次单交换 选择性培养基为： 7H10 +10% 蔗糖 +50 mg/ml 潮霉素+ X-Gal ，然后通过检测卡那霉素敏感性来加以确认。 第二次单交换 两步筛选无标记基因突变株 确认敲除菌株 其他说明 上下游同源臂长度的选择：1-2 kb 小于1 kb时，同源重组的效率会下降地十分明显，最短不能短于700 bp。最长不能长于2 kb,过长不仅不会增加同源重组效率，反而会增加非理性重组发生的可能。 质粒DNA的处理：碱处理或UV照射处理 分枝杆菌中，RecA是介导同源重组发生的关键因素。当经过处理而局部受损的外源DNA进入分枝杆菌中时，同样会激活RecA，提高同源重组的发生率。 王庆忠.结核分枝杆菌利福平耐药相关基因突变检测及Rv2629 基因191A/c突变功能初步研究[D].复旦大学博士学位论文,2007:18. 其他说明 勤读力耕 立己达人 Thank you for your attention !