论文--电针对COH小鼠子宫内膜IGF-1的影响.docVIP

电针对COH小鼠子宫内膜IGF-1的影响 体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transplantation，IVF-ET）是目前治疗不孕不育症最有效的方法，随着控制性超排卵（controlled ovarian hyperstimulation, COH）方案的不断完善，临床受精率已达75%-90%，但临床妊娠率却徘徊在20%-30%水平[1]。针刺疗法与IVF-ET技术相结合，可有效提高临床妊娠率，综合其作用机制为：（1）改善卵巢功能，提高卵母细胞质量，促进卵泡发育成熟[2-4]（2）改善子宫内膜容受性[5、6]；（3）缓解紧张、焦虑等不良情绪[7、8]。近年来研究表明，人类子宫内膜具有完整的胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）系统[9]，在局部可通过自分泌/旁分泌发挥作用，直接或间接地参与子宫内膜蜕膜化、胚胎着床及胚胎发育[10]。那么，针刺改善临床妊娠率是否由IGF-1所介导呢？为回答此问题，我们观察了电针对COH小鼠子宫内膜IGF-1及其mRNA表达的影响，探讨电针提高临床妊娠率的可能机制。 1.材料与方法 1.1实验动物 SPF级昆明纯种性成熟小鼠，雌性鼠8周龄，体重30~35克；雄性10周龄，体重35~40克，用于交配，由武汉生物制品研究所有限责任公司提供[SCXK（鄂）2012-0003]。适应性喂养 1 周后，所有雌性小鼠进行阴道涂片观察动情周期，动情周期正常者纳入本实验。饲养条件为自由摄食、饮水，环境温度18~22℃，相对湿度60~80％。 1.2药品与试剂 曲普瑞林（法国益普生生物制药有限公司），孕马血清促性腺激素（宁波三生药业有限公司），绒促性素（HCG，丽珠集团丽珠制药厂），KSOM培养液（美国Caisson Labs，2570292），M2培养液（中科迈晨（北京）科技的限公司，E12UE050），Trizol（Invitrogen，15596-018），cDNA第一链合成试剂盒（Fermentas，#K1622），β-actin抗体（武汉博士德生物工程有限公司，BM0627），IGF-1抗体（Arigobio，ARG20317）。 1.3主要实验仪器 体视显微镜（日本尼康，SMZ800N），倒置显微镜（日本奥林巴斯，CKX31），二氧化 限公司，EDC-810），水平电泳仪（北京君意东方电泳设备有限公司，JY300）。 1.4实验方法 （1）模型制备 依据文献[11]，于每日上午腹腔内注射阿拉瑞林40μg/100g体重，连续9天，进行降调节；至第9天同时注射孕马血清促性腺激素40IU/l00g体重，1次，进行Gn启动；48小时后注射绒促性素（HCG）100 IU/l00g体重。 （2） 动物分组 COH造模后，随机分为COH组、电针组，每组又分为供体鼠（提供胚胎）和受体鼠（接受移植胚胎，亦称假孕鼠）。另设自然周期组，亦分为供体鼠和受体鼠，每组供体鼠和受体鼠各10只。 （3）处理方法 ①雄性结扎鼠的制备：纵形切开阴囊处皮肤及包膜，分离暴露双侧输精管，切断结扎。1周后，与雌性小鼠合笼，无妊娠，证实输精管结扎成功。 ②胚胎获取及胚胎培养：注射HCG后供体鼠与雄性鼠按雌：雄=1：1合笼，次晨8时检查阴栓，于孕第二天下午14时打开腹腔，获取受精卵，培养箱中培养。 ③受体鼠（假孕鼠）的准备：与供体鼠同步，受体鼠与雄性结扎鼠1：1合笼，次晨检查阴栓，见阴栓者为假孕小鼠，逐一标记见栓日期。 ④胚胎移植：于胚胎培养第68小时，将供体鼠的胚胎移植至本组同日见阴栓的受体鼠内，每侧子宫种植胚胎8个。 ⑤电针治疗：电针组（供体鼠和受体鼠）于HCG注射日行电针治疗，至取材停止针刺，1次/日。取“关元”、“中极”、“三阴交”，采用φ0.16×7mm美容针灸针，进针2mm，关元、中极接韩氏电针仪（HANS-100A），连续波，频率2Hz，强度1mA，留针20min。自然周期组和COH组（包括供体鼠和受体鼠）不行电针治疗。 （4）胚胎种植的观察和计数 于种植后第6天向小鼠尾静脉注射0.3ml 0.5%台盼兰，5min后脱臼法处死小鼠，75%酒精消毒腹部皮肤，打开腹腔，暴露双侧子宫，被台盼兰染为蓝色部位为小鼠胚胎着床位点，计数妊娠小鼠及着床位点数，计算各组小鼠妊娠率（孕鼠数/总动物数）和平均着床位点数（各组总着床位点数/各组孕鼠数）。 （5）子宫内膜IGF-1蛋白检测 提取组织总蛋白80μg，蛋白变性后SDS电泳、转至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉的TBST室温摇床封闭2h，加入IGF-1抗体（1:500），4℃孵育过夜，加HRP标记二抗（1:50000）室温摇床孵育2h，应用Bio-Rad图像分析系统对目的条带进行光密度扫描，IGF-1蛋白相对量=I