实验动物的组织处理.docxVIP

肝脏好比人体化工厂，人体各种营养物质的转化合成都由肝脏完成， 各种各样的毒素亦要经过肝脏来排解。少量喝酒，经过肝脏解毒代谢后， 变成无毒的物质排出体外；若长期大量饮酒，酒精的代谢产物乙醛对肝细胞 的毒性作用就非常人。在多数情况下，人们并不知道自己患上了酒精性法 病，等到出现症状以后，如肝区疼痛、全身无力、消化不良、食欲不振、 恶心呕吐、腹胀腹泻等症状，到医院检查发现肝功能异常，如转氨酶升高， 这已是酒精性肝炎。此时若不及时治疗或继续喝酒，很容易发展成为酒精 性肝纤维化和酒精性肝硬化，继而还会出现腹水、消化道大出血等，重者 有生命危险。 酒精肝症状表现：轻症会出现腹胀、乏力、肝区不适、厌食，还有黄 疸、肝肿大和压痛、面色灰暗、腹水、浮肿、蜘蛛痣、发热、白细胞增多 （主要因此是中性粒细胞增多）类似细菌性感染，少数有脾脏肿大等症状， 血清胆红素＜100iimol/L；中重度除上述症状外，有持续低热、腹泻、 四肢麻木、手颤、性功能减退、男性有勃起功能障碍等，肝功能检查有AST 和ALT中度升高、AST/ALT比值接近3等指标。 酒精肝病理变化：从整体酒精性肝病的发病而言，酒精肝只是酒精性 肝病早期出现的一种疾病，或者说属于酒精性肝病的一个病理阶段，若继 续发展会发牛肝细胞的炎症，以及肝脏纤维化，肝细胞坏死等病理变化。 这主要与酒精（乙醇和乙醛）对肝脏的直接毒理作用，以及伴有的营养不 良等因素有关。乙醛（高活性化合物）干扰肝细胞功能，损害微管，使蛋 白、脂肪排泌障碍而在肝细胞内蓄积，乙醇、乙醛被氧化时，产生还原型 辅酶I,阻碍肝脏释放蛋白质，抑制糖原异生作用，阻碍维生素的利用， 促使和导致脂肪肝的形成；乙醇可阻碍硫胺等向活性型转变或阻碍其利用， 最终加速导致肝细胞的脂肪浸润、炎症、坏死。而口酒精引起的高乳酸血 症，通过刺激脯氨酸疑化酶的活性和抑制脯氨酸的氧化，可使脯氨酸增加， 从而使肝内胶原形成增加，一些炎性细胞因子和乙醇、乙醛的毒性作用可 使肝星状细胞、肝细胞、枯否细胞活化，分泌一些细胞外基质，加速和促 使肝硬化 实验动物的组织处理 取组织块5 g,置于组织匀浆器中，加入冰浴冷却的生理盐水或者0. lmol/L 磷酸缓冲液（PH7.4） 5 niL研磨成50%的组织匀浆液，迅速放入冷冻离心机， 5000r/min离心15 min,取上清液，分装，-4°C冷冻后待用，其余的组织亦置 于-4°C冷冻保存。 组织匀浆液的蛋白质含量的测定 1实验原理 蛋白质含量的测定采用Bradford测定法。 该方法基于考马斯亮蓝G-250能与蛋白质通过范得华相互作用形成蛋白质 —考马斯亮蓝复合物蓝色溶液，在595 nni处有最大吸收值。蛋口质-考马斯亮蓝 复合物溶液颜色的深浅与蛋白质的浓度成止比。 2.2试剂配制 （1）蛋白质标准溶液： 精确称取lOOrng牛血清白蛋片，加双蒸水溶解并定容到100mL,溶液即为 1000 u g/mL牛血清白蛋白溶液。 考马斯亮蓝G-250蛋白试剂： 称取1 OOmg考马斯亮蓝G-250溶于50mL 90%乙醇溶液中，加入85%的磷酸 lOOmL,充分混匀，用双蒸水定容至lOOOmL,混匀后即成。 2.3实验方法 0-1000 u g/mL标准曲线的制作 取6支试管，按表2进行配制。 進确吸取所配制各管溶液0.05mL,分别放入lOmL具塞试管屮，再加入2.5mL考马斯 亮蓝G-250蛋白试剂，盖塞，将试管中溶液纵向倒转混合，放置2min。 用光径为10mm的比色杯在595nm下比色，以吸光值为纵坐标，牛血清白蛋白 浓度为横坐标绘制蛋白标准曲线。 表1蛋白质标准曲线的配制 试管编号 试剂(mL) 1 2 3 4 5 6 牛血清白蛋白 溶液 (1000 ug/mL) 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 双蒸水 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 0D595nm 0. 000 0. 228 0. 375 0. 502 0. 704 0. 845 样品溶液蛋白含量测定(要稀释，50%的组织液要稀释50倍) 吸取样品溶液0. 05mL放入具塞试管中，加入2. 5mL考马斯亮蓝G-250蛋白 试剂，充分混合，放置2min后用光径为10mm的比色杯在595nm下比色测定吸光 值01民湎，对照标准曲线即可求出样品溶液屮蛋口质的浓度(U g/mL),通过进一 步的计算即可得岀样品溶液蛋白质总含量血)。 样品溶液中蛋白含量(mg)= 1381. 9X0D?海口 (mg/mL) X样品溶液体积(mL) X稀释倍 1000 数 3?小鼠肾组织谷丙转氨酶 (ALT)含量测定 1实验原理 ALT作用于由丙氨酸及a-酮戊二酸组成的基质，在一定的反应条件下，产 牛一定量的丙酮酸。在酶反应到规定时间时，加入2, 4-二硝基苯月井