生殖生物学理论与相关技术-20151217克隆技术.ppt

实验方法 常规核移植方法如图示 胚胎的激活 胚胎移植 胚胎经输卵管伞转移入输卵管内3cm处 分娩及护理 微卫星检测 DNA提取：采用UltrapureTM基因组DNA快速提取试剂盒。 微卫星检测：编号后由上海基康生物技术公司检测 SRY检测 引物（s5’GTGAAGCGACCCATGAACGCA3’, a 5’CGGGTATTTCTCCTGTGCAT3’ ）, 产物大小198bp MPF在细胞周期中的活性变化 3 供体细胞和受体细胞的细胞周期特点 供体细胞: 可能为G1, S, G2, M 胚胎细胞: 90%以上为S期 体细胞: 70%以上为G1/G0期 受体细胞: MⅡ期卵母细胞: 含有高水平的MPF a, 以MII期卵母细胞为受体时 MⅡ期卵激活前 激活后 MPF活性高 MPF活性低 所以：当受体处于MⅡ期时，只有当供体处于G1期时，克隆胚 胎才能保持正常的二倍体。 a1,当以胚胎细胞为供体时 问题: 胚胎细胞90%为S期，而不是G1期 策略: 用 aphidicolin或hydroxyurea处理, 使供体细胞停止在G1期. 结果: 克隆胚胎的发育能力提高 结论: 使用G1期细胞为好 a2,当以体细胞为供体时 活跃增殖的细胞（cycling)：70％以上为G1/G0期, 血清饥饿的细胞（Serum starvation): 80％以上为G1/G0期 所以不存在染色体倍性异常的问题 关于G0期细胞必要性的争议 1. Go期细胞的优势 Campbell（专利）观点: a, 染色体倍性正常 b, 染色质结构利于reprogramming c, 胞质内RNA和蛋白质含量少，减少不利影响 2. 反证 a, 使用分裂细胞( cycling cell) b, 对比G0期和分裂期细胞 c, 细胞周期分析 d, 使用G1期细胞 f, 使用G2/M期细胞 以间期卵母细胞为受体时(激活后) 所以：当以间期卵母细胞（激活后）为受体时，处于G1期、S期和G2期的供体细胞，克隆胚胎的染色体倍性均保持正常 间期卵激活后 MPF水平低 以胚胎细胞为供体时 问题：受体卵母细胞处于M期 策略: 核移植前激活受体卵母细胞 ,使之 处于间期 (Campbell 专利) 结果: 克隆胚胎的发育能力提高 结论: 使用激活后的间期卵母细胞好 以体细胞为供体时 Wakayama, et al. 1998, Nature Wells, et al. 1999, Biol Reprod 使用MⅡ期卵母细胞好。 延迟激活有利于供体核的重新编程 (2)细胞周期协调对核重新编程的影响 重新编程: reprogramming a,间期受体: 核膜不破裂,染色体不凝集,核不膨大, 胚胎发育能力减弱 b, MII期受体: 核膜破裂,染色体凝集,核膨大 核质物质交换, 胚胎发育能力提高 所以：使用MII期的卵母细胞 如何协调体细胞克隆过程的细胞周期 策 略：延迟激活（delayed activation) ——先融合后激活 即：将供体细胞核移植到MⅡ受体胞质中后, 3-6hr后再激活卵子 可能机制：供体核在高水平MPF作用下，核膜破裂，染色质浓缩 细胞核与细胞质充分相互作用，有利于核的重新编程 （reprograming) 类似策略：连续核移植。 目的是使细胞核多次与受体细胞质相互作用 7. Prospects of cloning (1)克隆技术的成功将会大大提高畜牧业的生产效率，加强濒危动物的保护力度。 (2)克隆与转基因技术结合将大幅度提高转基因效率，克服外源基因随机整合带来的消极影响。 (3)克隆人的胚胎与胚胎干细胞技术结合可能会解决目前人类器官修复和移植过程遇到的免