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放射性核素与抗原抗体的结合物制备 一、基本方法 氯胺T(ch-T)法是常用的标记方法，氯胺T是一种氧化剂，它能使125I+液中带负电荷的碘离子氧化成带正电荷的碘，然后取代抗原酪氨酸残基芳香环上的氢 ch-T是对甲苯磺基酰胺的N-氯衍生物钠盐，在水中易分解成具氧化性的次氯酸：次氯酸可将125I﹣氧化成带正电荷的125I+，后者可取代抗原（或抗体）中酪氨酸残基苯环上的氢原子，形成稳定放射标记物；最后加入还原剂偏重亚硫酸钠（Na2S2O5）可终止反应 125I结合物制备 直接标记法—氯胺T法 化学或酶促反应，将放 射性负电碘离子氧化成 碘原子或正电碘离子， 通过取代反应置换被标 记物分子中酪氨酸或酪 胺残基以及组胺残基上 的氢原子。 125I- Ch-T氧化 125I或125I+ 取代反应 125I-标记物 （混合物） 氯胺T(ch-T)法 使用无还原剂的高比放射性碘源 ch-T用量要低 控制总反应体积200μl 反应时间1分钟～2分钟 弱碱性反应条件 二、放射性核素标记结合物的纯化 标记反应后形成的结合物不能直接使用，需去除游离125I和其他杂质。 游离125I和125I标记抗体（抗原）分子大小相差悬殊，采用凝胶层析即可分离，如葡聚糖凝胶（Sephadex G-50）柱层析。 125I结合物纯化 凝胶过滤法 离子交换层析法 聚丙烯酰胺凝胶电泳 高效液相色谱法 去除游离125I 去除过度标记的标记物 三、放射性核素标记结合物的鉴定 放射性核素结合物的鉴定包括放射化学纯度、比放射活性和免疫活性三个参数： 放射化学纯度指在标记物中结合在抗原（或抗体）上的放射活性占该标记物总放射活性的百分比。 比放射活性是指单位质量标记物中所含的放射性强度，也可理解为每分子抗原（或抗体）平均所结合放射性原子数目，常用Ci/g或Ci/mmol表示。 免疫活性指标记物与抗原或抗体反应的能力。免疫活性测定方法，用少量标记物与过量抗体反应，测定与抗体结合部分（B）的放射活性，并计算与加入的标记物总放射活性（T）的百分比（B/T）。 125I结合物鉴定 标记物质量 高纯度 高比放射活性 完整免疫活性 放射化学纯度 单位标记物中结合于抗原或抗体上的放射活性占该标记物总放射性的百分比 应大于95% 免疫活性（immunoreactivity） 标记物与抗原或抗体结合的能力 标记物与过量抗体反应百分比 该值越大, 标记物免疫活性好 四、放射性核素标记结合物的保存 放射性核素标记结合物在2~8℃避光保存。注意放射防护，废弃物须按放射防护条例规定处理。标记物长期贮存后可因脱碘和自身辐射造成蛋白质破坏而形成碎片，同样可以采用上述方法对标记物重新进行纯化。 第四节 荧光素与抗原抗体结合物的制备 一、基本方法 荧光素与蛋白质结合的化学反应基团主要有三种类型： 酰基氯，由磺酸制备。 异硫氰酸和重氮盐类，这两种通常由相应的胺制备，通过化学键作用于相应的抗原、抗体反应结合。 目前标记方法主要是透析法和搅拌法两种： 以FITC标记抗体（IgG）为例：FITC含有异硫氰基，在碱性条件下能与IgG的自由氨基结合，形成荧光抗体结合物。 FITC标记结合物制备 荧光素标记抗体的方法 原理:利用抗体蛋白的自由氨基与FITC的异硫氰基在碱性溶液中形成硫碳酰胺键，使抗体与FITC结合成荧光抗体。 标记方法: 搅拌法：适于标记体积较大、蛋白含量较高的抗体。标记时间短，荧光素用量少，但有非特异性染色。 透析法：适于标记样品量少，蛋白含量低的抗体。标记比较匀，非特异染色较低。 透析法 二、荧光素标记结合物纯化 抗体标记完成后，还应对标记抗体进行纯化，以除去未结合的游离荧光素，纯化方法可采用透析法和凝胶过滤法。 透析法 将标记的抗体放入透析袋中，不断更换透析液透析1周左右，直至透析液在紫外灯照射下不发出荧光为止，本法适用于蛋白含量低的标记物。 凝胶过滤法 将标记的抗体通过SephadexG25或G50凝胶柱，洗脱第一峰为荧光素标记抗体峰，第二峰为游离荧光素峰，收集第一峰即可。本法简便快捷，可在数小时内完成。 AE特性 化学发光反应简单，无需催化剂，背景噪声低。 极其稳定，如2-甲基吖啶酯，因其独特的结构使其有效期长达1 年甚至更久。 发光过程快速，1秒内光子散射达高峰，整个过程在2秒内完成。 电化学发光剂 是指通过在电极表面进行电化学反应而发出光的物质。 特点：①反应在电极进行； ②电子供体为：三丙胺（TPA） ③化学发光剂：三联毗啶钌 三联毗啶钌 分子结构图 电化学发光剂 酶促反应发光剂 酶促反应发光剂： 是利用标记酶的催化作用，使发光剂（底物）发光，这一类需酶催化后发光的发光剂称为酶促反应发光剂。 鲁米诺及其衍生物 AMPPD