第五节 流式细胞术专题课件.pptx

实验五 流式细胞术1实验背景 理论要点， 技术方法实验步骤在操作中发现问题，总结经验结果分析 判断+/－性实验目标理解原理，学会操作。1、了解流式细胞术的组成及原理初步了解流式细胞术的工作元件及基本应用原理2、了解流式细胞术的应用能够认识流式细胞术的应用，特别是常用的一些功能3、学习并掌握流式细胞术结果的分析能够基本看懂结果图，重点掌握“门”和“补偿”两个概念01 实验目标 流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM；或Fluorescence Activated Cell Sorting，简称FACS）是一种快速、准确、批量，检测直线流动状态中单个细胞多项物理及生物学特性，加以分析定量的技术。检测速度快，分析样本量大在极短时间内可分析大量细胞，这是流式不同于其他细胞分析仪器的主要特点，可以每秒钟上万个细胞的速率进行测量。可检测的样本种类多样各种细胞（如外周血，骨髓，实体组织，悬浮或贴壁培养的细胞），微生物，人工合成微球。02 实验背景 流式细胞术可以检测的样本：0.2μm50μm流式细胞术可以检测样本哪些信息？相对大小 （Forward Scatter ，FSC)相对颗粒度或内部复杂程度 （Side Scatter ，SSC)通过荧光强度可以分析：1，细胞表面标志物2，细胞内部因子3，细胞分泌因子4，DNA含量等……02 实验背景 流式细胞仪组成及原理Fluidics (液流系统)流体动力学聚焦样本形成单细胞流Optics (光学系统)激发和收集光信号Electronics (电子系统)扩大信号，将光信号转化为电信号，处理信号并存储于电脑02 实验背景 液流系统液流系统将样本悬液聚焦在光源的中心处检测光源488 nm laser过滤网废液桶鞘液桶样品管02 实验背景 光学系统复杂的荧光信号被不同分色镜和滤光片分解02 实验背景 电子系统光电倍增管可以将光信号变成电信号，并产生信号放大的作用02 实验背景 流式结果图直方图 ·横坐标代表荧光信号或散射光信号相对强度，可以是线性或对数坐标。·纵坐标一般是细胞数。02 实验背景 流式结果图散点图 X坐标为该细胞某参数相对含量，Y坐标为该细胞另一个参数的含量，可以将细胞亚群分开。02 实验背景 流式细胞术原理总结颗粒由液流包裹到达检测区，产生信号荧光信号被不同分色镜和滤光片分解光电倍增管将光信号转换成电信号并产生放大效应每个颗粒的信息存储成数据格式，记录下来流式能够提供的信息包括：颗粒的相对大小，内部复杂程度，和标记上去的荧光强度02 实验背景 细胞结构·细胞大小·细胞颗粒度·细胞表面积·核浆比例· DNA含量与细胞周期· RNA含量·蛋白质含量· …… 细胞功能·细胞表面/胞浆/核的特异性抗原·细胞活性·细胞内/外的细胞因子·激素结合位点、细胞受体·蛋白磷酸化· pH值·钙离子浓度·细胞膜电位、线粒体膜电位· ……02 实验背景 临床应用· HIV免疫分型，CD4绝对计数·白血病和淋巴瘤的免疫分型·肿瘤的细胞周期和倍体分析·网织红细胞计数·细胞移植的交叉配型和免疫状态监测·干细胞计数·残量白血病细胞检查· HLA-B27检查·血小板功能及相关疾病02 实验背景 样本收集及处理制备单细胞悬液流式细胞术实验操作流程及数据分析免疫荧光染色上机检测数据分析03 实验内容·步骤 1、设“门”指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。根据门的形状又分为了线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状门和十字门。04 实验结果 04 实验结果 2、荧光补偿似乎CD8 T细胞的“CD4表达量”稍高于非T细胞，CD4 T细胞似乎也能“表达少量”CD804 实验结果 PE只染了绿色荧光（FITC）的细胞，竟在橘黄色（PE）通道检测出信号！？04 实验结果 04 实验结果 解决方法设各种单染管，调整每种荧光阴性群位置04 实验结果 The End