实验十六 细胞色素C提取及分析.ppt

在碱性pH时，使吸附更有效，但选择性降低。金属螯合亲和层析行为在很大程度上，由被吸附的肽和蛋白质分子表面咪唑基和巯基的稠密程度所支配，吲哚基可能也很重要。用IPTG诱导表达的蛋白质含有特定的组氨酸标记物，这种可溶性蛋白质能用金属亲和层析法进行分离，且操作简单，快速，纯化效率高。 三.试剂与器材 ( 一 ) 试剂 . 1. 0.05mol/L EDTA—0.5mol/L NaCL溶液50mL 2. 2mol/L NaCL 溶液 50mL 3 1mol/L NaOH溶液 50mL 4 0.2mol/L NiSO4溶液 30mL 5 起始缓冲液：50mmol/L Tris-HCL; 500mmol/L NaCL; pH7.0 500mL 6 Chelating Sepharose Fast Flowus 4-5 mL 7??????大肠杆菌细胞裂解蛋白样品 10—20ml 8 ? 洗涤液：50mmol/L咪唑，50mmol/L Tris-HCL, 0.5mol/L NaCL,pH 7.0 9 洗脱液：300mmol/L咪唑, 50mmol/L Tris-HCL, 0.5mol/L NaCL.pH7.0 ( 二) 器材 1．1.5cm X 50cm层析柱 、自动分部收集器 、 紫外分光光度计 、 紫外检测仪及记录仪 四.操作方法 1.样品的制备 细胞的培养及荧光蛋白表达看实验十，细胞的破碎及蛋白的收集如下： 收集在25℃培养的细胞培养液，5000r/min，离心10min，去上清液，菌体用起始缓冲液洗涤一次，离心收集菌体，用三分之一（细胞培养液）体积的起始缓冲液充分悬浮，冰浴下进行超声波处理，功率为400W，工作4秒，间隙4 秒，为一次，99次为一周期。共处理六周期 。然后8000r/min。离心30min，取上清液。放冰箱备用。 2．2.亲和层析柱的安装 把层析柱固定在铁支架上，柱下端出口封闭。加入少量的无离子水，排去下端的空气泡。取出20%乙醇浸泡的螯合凝胶4mL到烧杯中，加入少量的无离子水制成糊状，沿着贴紧柱内壁的玻璃棒把糊状凝胶倒进柱内，打开下端的排水口，让亲和凝胶剂隋水流自然沉下。亲和层析剂为4—5mL。 4．上样： 先从20mL裂解上清液中取出50μL用于电泳，作为亲和层析分离前上清液中的总蛋区带对照图谱。然后以每分钟1mL的流速上层析柱，分部收集流出液，每管3ml,（测得的OD值曲线为穿流峰，取最高的一管样品液用作电泳）。再用10mL起始缓冲液过层析柱，操作和前面一样。 5.洗涤： 用含50 mmol/L咪唑的洗涤缓冲液25mL冼脱，分部收集洗脱液，每管5mL，取中间管样品电泳。 6. 洗脱： 用含300mmol/L咪唑的洗脱缓冲液10mL洗脱，用指管分部收集洗脱液。每管收0.5mL.（测得的OD值曲线峰为目的蛋白峰，GFP）。 7。? 12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测： 分别取200μL穿流峰流出液、50mmol/L咪唑缓冲液洗涤的流出液和300mmol/L咪唑缓冲液洗脱的流出液。外加一个上柱前的样品液作比较。进行12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测亲和层析分离纯化的结果。 ? 3． 8 亲和凝胶的再生处理： （ 1）用10 倍柱体积的再生溶液（0.05mol/L EDTA、 0.5mol/L NaCL）每分钟3ml流速过柱.。 （ （ 2） 用5倍柱体积的2 mol/L NaCL 溶液洗亲和层析柱 除去多余的EDTA. 流速3mL/分钟。 （ （3） 用5倍柱体积的1 mol/L NaOH溶液洗涤层析柱， 流速2mL/分钟。 （（ 4） 用10倍柱体积的无离子水洗至pH8-9，流速3mL/分 钟。 （5） 用2倍柱体积的0.2mol/L的硫酸镍溶液过层析柱,使 凝胶金属镍离子结合, 流速2mL/分钟。过完后保育 5 分钟.。 （ 6） 用10倍柱体积的无离子水洗涤层析柱除去多余的镍 离子。流速3mL/分钟. （ （7） 用5 倍柱体积的起始缓冲溶液平衡层析柱，备用。 五。注意事项与提示 1 。