液相色谱法的建立.docxVIP

液相色谱法的建立第一章 结论1，引言2，开始前应知道3，样品的预处理与检测4，建立分离5，完善HPLC方法 1，引言HPLC方法建立的步骤：（1）有关样品的情况，明确分离目的（2）是否需要特殊的HPLC步骤、样品预处理等？（3）选择检测器和检测器设置（4）选择液相色谱法；进行预实验；估计最佳分离条件（5）优化分离条件（6）检查出现的问题或所需的特殊步骤（7）定性方法；定量校正（8）论证方法使之进入常规实验室2，开始前应知道2.1 样品的性质包括：所含化合物的数目；化合物的化学结构（官能团）；化合物的分子量；化合物的pKa值；化合物的UV光谱图；化合物在样品中的浓度范围；样品的溶解度等。两种模式：（1）理论型：依据样品的“化学性质”选择最佳初始条件；（2）经验型：直接开始色谱分离，而对样品的性质不大注意。2.2 分离的目的（1）主要目的是定量分析？一种物质的检出？未知样品组分的确认？（2）是否有必要解析出样品的所有成分？（3）如要求定量分析，准确度与精密度需多大？样品的主要成分的精密度通常能达到±1~2%（4）该方法应设计多少种不同的样品基质？（5）一次将分析多少样品？当一次分析的样品数超过10个时，运行时间一般应控制在20min以内（6）即将使用该方法的实验室中，有哪些HPLC设备？实验人员操作技能如何？色谱柱能否恒温？HPLC系统能否做梯度洗脱？3，样品的预处理与检测（1）可直接进样的溶液（2）需稀释、pH缓冲、加入内标或其它定容操作的样品。（当样品溶剂成分接近流动相时，一般不会产生基线波动等问题）（3）必须首先溶解或提取处理的固体（4）样品需预处理以除去干扰物和/或保护色谱柱或仪器不受损害检测器：首选可变波长紫外（UV）检测器。4，建立分离方法4.1 选择HPLC分离模式与起始条件样品：一般样品：小分子（分子量小于2000）可分为中性样品和离子样品（酸、碱、两性化合物和有机盐类）特殊样品：大分子、无机离子、对映体、生物样品、蛋白质、肽类等首次HPLC分离的较好实验条件分离条件 较好的首要选择色谱柱 ???? 尺寸（长度，内径）????? 15×0.46cm???? 粒度??????? 5μm???? 固定相??????? C8或C18流动相 ???? 溶剂A和B????? 缓冲液—乙腈???? %B 80~100%???? 缓冲液（化合物、pH、浓度） 25mM磷酸钾，2.0＜pH＜3.0???? 添加剂（如胺改性剂、离子对试剂） 开始时不用流速 1.0~2.0mL/min温度 35~45℃样品大小 ????? 体积 ＜25μL????? 重量 ＜100μg主要HPLC方法的特性方法/特点/色谱柱 何时应该使用该方法？反相HPLC ?????? 流动相：水-有机溶剂?????? 色谱柱：C18（ODS）、C8、苯??????? 基、三甲基硅烷（TMS）、氰基 能溶于水-有机混合物的大多数样品，尤其是中性或非离子化合物的首选离子对HPLC ?????? 流动相：水-有机溶剂，控制pH???????? 的缓冲液和离子对试剂????? 色谱柱：C18、C8、氰基 离子或可电离的化合物，尤其是碱或阳离子样品的良好选择正相HPLC ????? 流动相：有机溶剂混合物????? 色谱柱：氰基、二醇基、氨基、??????? 硅胶 当反相或离子对HPLC无效时的第二个良好选择；不溶于水-有机混合物的亲脂样品的首选4.2 开始方法建立用上表的起始条件，在首次进样之前，唯一需做的选择是流动相中的有机调节剂比例（%B）。通常不推荐用中等强度的流动相开始方法建立。更好的选择是先用非常强的流动相（如80-100%B），然后按需要降低%B。另一种有别于起始等度分离的方法是梯度洗脱。其优点：（1）确定最好的方法是用等度还是梯度洗脱；（2）估计出下一次实验（等度）的最佳溶剂强度。4.3 改善分离HPLC方法建立的目标目标?????????????????? 评论分离度???????????????? 精密和普适性好的定量分析要求Rs＞1.5分离时间?????????????? ＜5~10min时日常工作较理想定量?????????????????? 含量测定：≤2%；要求不高的分析：≤5%；痕量分析：≤15%压力?????????????????? （如果为新柱）＜150bar最好，＜200bar通常是基本的要求峰高?????????????????? 大信噪比的窄峰最好溶剂消耗?????????????? 每次运行少用流动相最好4.4 可重现的分离在方法建立过程中