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海洋源金属硫蛋白的提取、纯化和检测 摘要 金属硫蛋白（metallothionein ，MT ）广泛存在于人体、动物、植物以及微生 物中，是一种高金属含量、无芳香族氨基酸、低分子量、富含半胱氨酸的功能独 特金属结合蛋白。具有清除自由基、抗击电离辐射、重金属解毒、参与微量元素 代谢、机体应激反应和增强机体对不良状态适应能力等功能。广泛应用于食品、 医药、保健、生物工程等领域。MT 规模化生产主要以兔肝诱导，但其资源有限， 产量低。 本研究以鱼下脚料鱼肝作为MT 提取源，提取鱼肝中的MT ，通过多级膜分 离技术对提取液进行粗分离，采用凝胶层析和离子交换层析对MT 粗品进一步精 细分离。同时，以兔肝MT 作为检测标准品，分别建立了紫外和HPLC 两种检测 方法，用以确定提取液中MT 含量。主要研究结果如下： 1.以兔肝MT 作为标准品，采用 5,5 ˊ-二硫硝基苯甲酸（DTNB ）作为MT 巯基衍生化试剂，通过优化反应条件，应用比色法测定 412nm 处显色产物硫代 硝基苯甲酸阴离子（TNBA ）的量确定金属硫蛋白含量。结果表明：MT 含量在 2~15μg 和 10~150μg 范 围内呈良好线性，线性回归方程分别为 2 A412=0.0059C+0.0251 和 A412=0.0052C+0.0201 ，相关系数分别为 R =0.9942 和 2 R =0.9997 ，平均回收率为 99.94% （n=6 ，RSD=0.27% ），精密度良好（n=6 ， RSD=0.7% ），MT 最低定量限可达到2μg，从而建立了一种操作简便易行的金属 硫蛋白快速检测方法。 2. 以兔肝MT 作为标准品，采用4-氟-7-硫代苯并呋喃铵（SBD-F ）衍生化试 剂作为荧光反应试剂，流动相为20mmol/L pH=7.5 的磷酸钾缓冲液，乙腈，甲醇 体积比为80:18:2，流速0.5ml/min，激发波长380nm，发射波长510nm，检测SBD-F 与MT 衍生反应产物的荧光强度。结果表明：MT 含量在0.02ug/ul~0.2ug/ul 的范 围内呈现良好的线性关系，线性回归方程 y=4.3E+7x-9.6E+5 ，相关系数 2 R =0.9983 ，平均回收率 98.03% （n=6 ，RSD=1.76% ），精密度良好（n=6 ， RSD=2.21% ），MT 的检测限5ng，最低定量限达7.5ng，从而建立了一种高效精 确的检测金属硫蛋白含量的方法。 II 3.采用匀浆离心法提取鱼肝中MT ，以Tris-HCl 作为提取缓冲液，以每克鱼 肝中提取的MT 含量作为响应值，通过单因素试验确定对响应值影响较大的四个 因素，在四因素三水平的基础上，通过响应面试验优化提取条件。确定最佳提取 条件：提取液pH=8.5，提取温度46℃，Tris 浓度0.25mol/L，物料比1/7。 4.运用多级膜分离技术对鱼肝MT 匀浆提取液进行粗步纯化，先通过0.1um 陶瓷膜将匀浆液中的颗粒比较大的杂质去除，然后将透过液通过30K 的CV 材 质的平板膜，去除大分子蛋白等杂质，收集透过液，通过2K 卷式膜，收集浓缩 液，浓缩，冻干，得到MT 粗品。 我国鱼类资源丰富，每年都产生大量鱼下脚料，而对其利用率却非常低。以 鱼下脚料作为MT 提取源，提取其中的MT 并进行产业化生产，不仅具有较高的 经济效益，还有生态效益。 关键词:金属硫蛋白；海洋源；提取；纯化；检测； III The extraction,purification and detection of metallothionein in marine sources Abstract Metallothionein (MT) is a high me