细菌总数检测作业指导书.doc

细菌总数检测作业指导书 1.试剂和培养基配制 1.1试剂配制 1.1.1氢氧化钠溶液（160g/l）：称取氢氧化钠160g，溶于1000ml的蒸馏水中。 1.1.2吐温溶液：取1ml吐温80，溶于2000ml蒸馏水中。 1.2培养基配制 1.2.1 2216E培养基的成分：蛋白胨5g；酵母膏1g；磷酸高铁0.1g；琼脂20g；陈海水1000ml。 1.2.2制备：将上述成分加热溶解，用氢氧化钠溶液调节PH为7.6。分装于锥形瓶中，置高压蒸汽灭菌器中，在121℃下灭菌20min，而后，将此培养基分别倒入经灭菌的各平皿中，每平皿约15ml，待其冷却凝固，置冰箱内保存备用。 2.样品采集 2.1样品瓶 应用可耐灭菌处理的广口玻璃瓶或无毒的塑料瓶。灭菌前，把具有玻璃瓶塞得采样瓶用铝箔或厚的牛皮纸包裹，瓶颈系一长绳，在121℃经15min高压灭菌。 2.2水样采集 开瓶塞时，要连同铝箔一起拿开。手执长绳的末端，将采样瓶投入选定点的海水内，采集水下约10cm处水样。采好的水样需盖紧瓶塞，编号瓶号，按表所列项目记录。水样在瓶内要留下足够的空间以备在检验前摇荡混匀。该法适用于沿岸水域的采集。 2.3泥样采集 用小型底栖生物 柱状采泥器或弹簧采泥器采集泥阳，采泥器出水后，在预先选定的泥层中用无菌刮板取一定量的样品置于灭菌容器中。 2.4样品保存和储藏 采集的水样和泥样应立即送检，时间不超过2h，否则，应将样品置于冰瓶或冰箱中，但不得超过24h，否则影响检验结果。 3.测定步骤 3.1依水样量，按100ml水样加1ml吐温溶液，充分摇匀，使样品中的细菌细胞分散成单一细胞。 3.2以无菌操作法吸取1ml水样注入盛有9ml灭菌陈海水的试管内混匀，并依同法一次连续稀释至所需要的稀释度。稀释度依水样含菌量而定，以每平皿的菌落数在30~300个之间为宜，每种稀释度需有3个平行样。 3.3取0.1ml稀释水样，滴入制好的平皿上，用灭菌玻璃刮棒将菌液涂抹均匀，平放于超净工作台上20~30min，使菌液渗入培养基。 3.4将此平皿置于25℃恒温箱内培养7d，取出计数菌落。 3.5菌落计数法： a)当平皿上出现较大片菌苔时，则不应计数。 b)选择菌落数在30~300个之间的平皿，以平均菌落数乘其稀释倍数，即为该水样的细菌数。 c)若有两种稀释度的平均菌落数均在30~300个之间，则应按两者菌落数之比值决定，比值小于2，取两者的平均数，若大于2，取其较小的菌落数。 d)若所有稀释度中各不同稀释度的平均菌落数均大于300，则以稀释度最高的平均菌落数乘其稀释倍数。 e)若所有稀释度中各不同稀释度的平均菌落数均小于30，则用稀释度最低的平均菌落数乘其稀释倍数。 f)若所有稀释度都没有长出菌落，同时也没检出抑制物，则报告小于1乘其最低稀释倍数。