抗氧化酶活性等测定方法.pdfVIP

叶绿体的提取 一、试剂配置 1 、 PBS 提取 液： 每 L 水 依次 加入 MES(195.2 ×0.05=9.76g) 、山 梨糖 醇 (0.33 182.2=60.126g)× 、 NaCl （0.010 ×58.5=0.585g ）、MgCl （0.002 ×95=0.19g ）、EDTA（292.25 ×0.002=0.5845g ）、KH PO （200×0.0005=0.1g ）； 2 4 使用时加入 ASA-Na （198.1 ×0.002=0.3962g ）; 2、悬浮液：将 PBS 提取液中的 MES 换为 238.3 ×0.05=11.915g 的 HEPES （238.3 ×0.05=11.915g ）； 3、80%Percol ： 80ml 原液 +20ml 水； 40%Percol ：40ml 原液 +60ml 水； 实际配制： PBS 提取液 2000ml(3 个处理 *2 个品种 *3 个重复 *20ml*3 次 =1080ml), 悬浮液 100ml （3 个处理 *2 个品种 *3 个重复 *1ml*3 次 =54ml ）; 80%Percol 200ml; 40%Percol 200ml. （3 个处理 *2 个品种 *3 个重复 *3ml*3 次=162ml ） 二、提取步骤 1、 10g 鲜样加 20ml 提取 PBS （50mM MES PH6.1 ，含 0.33M 山梨糖醇， 10mM NaCl ，2mM MgCl 2 ，2mM EDTA ，0.5 mMKH 2PO4 ，2mM ASA-Na ，ASA-Na 使用前现配现加） 2、快速研磨，使叶片碎成绿豆粒大小， 4 层纱布过滤，去除残渣（注意过滤时不可用力挤压，以免叶绿体 膜破碎） 3、滤液 2000g 3min ，小心倒出上清液，将离心管放入离心机后，使离心机的加速很快上升到预定值 (水平 转头，加速度调到 9) ，约经 30s 后很快使其下降停止，整个离心持续大约 2-3min 左右完成； 4、沉淀用 1ml 提取液漂洗表面悬浮物； 5、用 1ml 悬浮液（ 50mM HEPES pH 7.6 ，含 0.33 mM 山梨糖醇， 10mM NaCl ，2mM MgCl 2 ，2mM EDTA ， 0.5 mMKH 2PO4 ，2mM ASA-Na ，ASA-Na 使用前现配现加） 将沉淀悬浮， 在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷， 或者用手握住离心管在冰块之间搅动，使叶绿体由于震动分散开来，不要用棉球吸滤，以防被膜压破。叶 绿体悬浮时要浓点，含叶绿素 2mg.ml -1 以上，这样有利于保持活性。 6、2000g 1min; 7、沉淀再用悬浮液悬浮 ;(悬浮液同 5，可以不做 ) 8、用 Percol 试剂进行梯度离心（将 3ml 含有 80%Percol （原液按 100%算 ）铺在 10ml 离心管下层，再把 3ml 40%Percol 铺在离心管中层，然后将 1ml 叶绿体悬浮液轻轻铺在离心管上层） 1500g 2-3min （用水平离 心头的离心机，离心机加速要缓慢上升，加速度调到 1），下降也要缓慢下降，否则会破碎 Percol 的浓度梯 度层的形成，取出会看到 3 层绿色带，最上层为破碎的叶绿体，沉在地层的为粗颗粒， 40-80% 的 Percol 之间的界面有一层绿色层为完整的叶绿体 ; 9、小心吸出，转移到悬浮介质中，使叶绿体浓度达到 1mg.ml-1 ；（计算：取叶绿体悬浮液 0.1ml ，加 4.9 ml