发给大家后小艾又修改的---水稻转基因实验操作.doc

水稻转基因实验操作 （谢越、赵建宁、艾鹏慧、孙淑斌整理） （2006.7） 水稻（日本晴）愈伤组织的诱导（以水稻成熟胚为试材诱导愈伤组织） 消毒： 取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子，按以下步骤消毒： 将种子放入100ml无菌烧杯中，倒入70%酒精消毒1分钟； 2）倒去酒精，加入100ml 30%次氯酸钠（NaClO）溶液（5.2%次氯酸钠），浸泡30分钟； 3) 倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍，最后一遍浸泡30分钟。（消毒期间要隔几分钟摇动，使种子充分得到消毒） 2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作） 1）种子放在无菌滤纸上吸干，放置成熟胚诱导培养基中，每皿12－14颗； 操作完毕用封口膜（Micropore TM Surgical Tape）封好培养皿，在30℃ 在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然散落的胚性愈伤组织（淡黄色，致密呈球状，有一定的硬度），在30℃ 挑取农杆菌单克隆或吸取所保藏的农杆菌（EHA105）菌液100μl于4ml YEP（含50mg/LSpec（针对AUSTRALIA载体）和50mg/L Str）培养液中，28℃，250rpm振荡培养20-36h至菌液OD600为0.8-1.0。（最好是挑取单克隆来培养，这样杂菌少，不至于以后选一时出现羧苄杀不死的菌，挑单克隆于三毫升YEP（含50mg/LSpec和50mg/L Str）培养24小时出现浑浊后，吸取一毫升加入4ml YEP（含50mg/LSpec和50mg/L Str）继续摇十个小时左右至菌液OD600 感菌与共培养 取培养好的工程菌液1ml于1.5ml离心管中，4℃，5000rmp，离心1min，去上清。用含200μmol/LAs的30ml AAM感菌液制成悬浮液。（As母液浓度100Mmol 2）将长到一定大小的水稻愈伤组织挑出，放入农杆菌悬浮液侵染5分钟（愈伤量没过50ml离心管锥形部位即可）。（不停的摇动） 3）将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上沥干30-40分钟； 4）将愈伤组织置于共培养基上（共培养的培养基不要放太多，因为培养的时间短，同时也要求滤纸不能太湿防止农杆菌长得太快，100毫升倒少于4皿）(共培养基上面垫上一层9cm无菌滤纸)。28℃ 四、愈伤组织的抗生素筛选 将愈伤组织取出，用无菌水清洗6次，其间需不停的振荡（组培室震荡机最大速率）。再用含500mg/L羧苄青霉素（Car）的无菌水浸泡30min-1h。最后置于无菌滤纸上沥干2h。 第一轮筛选：将沥干的愈伤转入含250mg/L羧苄青霉素（Car）和50mg/L潮霉素的选择培养基上进行第一轮选择，光照培养箱（30℃ 将获得的抗性愈伤转到含250mg/L羧苄青霉素（Car）和80mg/L潮霉素的培养基上进行第二轮选择，30℃ 将获得的抗性愈伤转到含250mg/L羧苄青霉素（Car）和80mg/L潮霉素的培养基上进行第三轮选择。光照培养箱（30℃ 五、抗性愈伤组织的诱导分化和生根 挑取选三中每堆中的三颗颜色鲜黄的抗性愈伤移入装有分化培养基的培养皿或分化罐中（每个分化罐最多放四堆），用封口膜封好，放入恒温培养室中，等待分化成苗（30-60天）。苗长至7－8厘米左右，把分化期间生长的根和愈伤用剪刀剪掉放入生根培养基中壮苗一到两周。 。 注：分化过程中一般不换培养基。 以上操作步骤皆在无菌条件下进行。 六、转基因苗的锻炼和移栽 转基因苗从分化到移栽时间大约为三个月左右。将根部和茎叶分化得较完好的苗从试管挑出（苗长至试管顶部，就要及时开盖），打开封口膜，加入适量无菌水（防止培养基长菌），炼苗3天，然后洗去琼脂，放到自来水中锻炼三天，同时做朝霉素筛选后阳性苗，并且分单独分棵，并做好标记（同一株系）移栽到温室的土钵中生长，检测。 七、转化苗的检测验证 1）GUS检测：将准备好的材料浸泡在染液里，37℃ 2）GFP检测：将材料放在共聚焦显微镜下观察成像。 3）PCR检测：设计潮霉素抗性基因引物HYG-F 5` CTTCTGCGGGCGATTTGT 3` HYG-R 5` CAGCGTCTCCGACCTGAT 3` PCR 反应条件为：95℃变性5min，55℃退火2min，72℃延伸2min， 72℃保温10min。反应结束后， 4）潮霉素快速检测转基因幼苗的方法（具体见附录）。 附录： 各种母液及培养基的配制方法 溶液配制 30%次氯酸钠溶液：V NaClO：VH2O=1：2 70%酒精：稀释100%或95%的乙醇至70% 激素的配制 激素 溶解方法 母液浓度 6-BA 加稀碱溶解（1M NaOH），再用蒸馏水定容 1 mg/ml NAA 加碱溶解（1M NaOH），再用蒸馏水定容 1 mg/ml 2，4-D 加少量酒精溶解，再用蒸馏