水中微生物的检测.docxVIP

综合实验二：水中细菌总数和大肠菌群的测定 一、实验目的 学习并掌握水样采集的方法、规则及注意事项； 了解检查水中细菌总数和总大肠菌群的测定方法及检测意义； 学习对所检测的水样作综合分析。 二、实验原理 1.水体的微生物污染问题日趋严重： 在各种水体，特别是污染水体中存在有大量有机物质，适于各种微生物的生长； 水中的微生物污染来源：土壤，以及人类、动物的排泄物污染； 水体中少数致病微生物（主要来自人或动物的粪便污染）可导致某些肠道传染病传播。 2.水微生物检测可用于评价水质情况，预报水质的污染趋势，以保证水质的卫生安全。 在实际工作中， 对水质卫生质量的评价和控制， 是无法对水体中各种可能存在的致病性微生 物一一进行检测。 一般选择有代表性的一种或一类微生物作为指示菌， 通过对指示菌的检测， 来了解水体是否受到过的微生物污染，是否有肠道病原微生物存在的可能。 3.水微生物的监测指标： ⑴菌落总数 ①是指 1ml 水样在营养琼脂培养基中，于 37℃经 24h 培养后，所生长的细菌菌落的总数。 ②检测意义： 作为一般性污染的指标， 即评价被检样品的微生物污染程度和安全性。 水样菌 落总数越多， 说明水被微生物污染程度越严重， 病原微生物存在的可能性越大， 但不能说明 污染的来源。 ⑵总大肠菌群 ①是指一群需氧及兼性厌氧的， 37℃生长时能使乳糖发酵， 在 24h 内产酸产气的革兰氏阴性 无芽胞杆菌。 ②检测意义：作为粪便污染的指标。水样总大肠菌群数的含量，表明水被粪便污染的程度， 而且间接地表明有肠道致病菌存在的可能。 4.多管发酵法测定总大肠杆菌群 37℃培养 24h，观察产酸产气情况， 产酸产气说明水 ⑴初发酵试验： 采用乳糖蛋白胨培养液 中存在大肠菌群，为阳性结果。 但是，有个别其他类型细菌在此条件下可能产气， 而不属于 大肠菌群；产酸不产气的发酵管，也不一定是非大肠菌群，因其量少，可能延迟 48 h 后产 气，这两种视为可疑结果，需进行下面的实验，才能确定是否是大肠菌群。 ⑵平板分离：对阳性管培养物及假阳性管培养物，接种于伊红美蓝培养基，观察菌落特征， 将符合大肠菌群菌落特征的菌落并进行革兰氏染色和镜检， 只有染色为革兰式阴性、 无芽孢 杆菌的菌落才是大肠菌群菌落。 ⑶复发酵证实试验： 将以上两次实验已证实为大肠菌群阳性的菌群， 接种于乳糖蛋白胨培养 液，进行复发酵证实试验，经 24 h 培养产酸又产气的，最终确定为大肠菌群阳性结果。 最后，根据确定有大肠菌群存在的初发酵管（瓶数目） ，查阅专用统计表，得出总大肠菌指 数。 三、实验用品 1.溶液及试剂： 蛋白胨、 Nacl 、 20%乳糖、 2%伊红水溶液、 0.5% 美兰水溶液、牛肉膏、 1.6%溴甲酚紫 乙醇溶液、草酸铵结晶紫染液、卢戈氏碘液、 95%乙醇、番红复染液、蒸馏水、 NaOH 溶液、 HCl 溶液等 2.仪器和其他用品： 试管、德汉式小管、三角瓶、注射器、搪瓷缸、培养皿、载玻片、电磁炉、玻璃棒、移液管、酒精灯、接种环、试管架、恒温培养箱、灭菌锅、显微镜等 四、实验内容及步骤 1.培养基配制 一倍乳糖蛋白胨培养液  三倍乳糖蛋白胨培养液 蛋白胨  2g  6g 牛肉膏  0.6g  1.8g 乳糖  1 g  3g NACL  1g  3g 1.6% 溴甲酚紫乙醇溶液  0.2ml  0.6ml 蒸馏水 200ml 200ml ⑴将蛋白胨、 牛肉膏、 乳糖及 NaCl 加热溶解于蒸馏水中，调 PH 至 7.2~7.4，加入 1.6%溴甲 酚紫乙醇溶液， 分装于试管和三角瓶中 （ 初发酵试管 10 支各 5ml, 初发酵三角瓶 2 个各 50ml; 复发酵试管 12 支各 5ml ），并加入德汉式小管。 115℃灭菌 20min. 伊红美兰培养基 蛋白胨  2g NACL  1g 蒸馏水  200ml 20% 乳糖  4ml 2% 伊红水溶液  4ml 0.5% 美兰水溶液  2ml ⑵将蛋白胨、 NACL 加入蒸馏水加热溶化， 再加入乳糖、 伊红水溶液、 美兰水溶液。 摇匀后， 115℃灭菌 20min 。灭菌后稍加冷却，无菌操作倒平板 12 个，每个培养皿约 15ml 。 2.自来水采样 先将自来水龙头用火焰烧灼 3min 灭菌，再开放水龙头使水流 5 min （经常用水的水龙 头放水 1～3min ）后，采集水样于无菌锥形瓶，约占瓶容量 80%，以便摇匀水样。 3.初发酵试验 在 2 个含 50ml3 倍浓缩的乳糖蛋白胨发酵烧瓶中， 各加入 100ml 水样。在 10 支含有 5ml 3 倍浓缩乳糖蛋白胨发酵管中，做好标记，各加入 10ml 水样，混匀后， 37℃培养 24h， 24h 未产气