共聚焦激光显微镜技术.docxVIP

激光共聚焦显微镜技术 绪论 激光共聚焦显微镜技术(Confocal Lasers Scanning Miccruscope CLSM)是将显微镜技术与激 光技术有效的结合，对具有荧光标记的物的形态及功能，通过计算机控制可以对其单层面进行快 速扫描，也可以对多个层面进行连续光片层扫描。逐层获得二维光学横断面图像，并可通过计算 机三维重组软件支持，获得真三维图像。 激光共聚焦显微镜汇集了激光技术、显微镜技术、免疫荧光技术、计算机及图像处理技术、精 密的机械技术等，高、精、尖细胞分析及工程技术于一体的新技术。使其成为形态学、分子细胞 生物学、神经科学、药理学、遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。 我们大家知道，从人类制作的第一台显微镜到现在以有几百年的历史来了，随着人类对生命科 学研究的不断深入，各种显微镜应运而生，使得研究细胞的手段以更加精密化和多样化。共聚焦 显微镜的理论是在1957年Marvin Minsky提出的，但共聚焦显微镜作为商品推出是在20世纪80 年代初期，早期的激光共聚焦显微镜在技术上很不完善，其应用也受到限制。至到20世纪80年 代末，光学系统设计不断改进，成像的质量和灵敏度都有所提高，进入90年代初，激光共聚焦显 微镜系统中逐步引入混合激光和紫外激光技术。90年代末由美国Meridian公司推出的新型激光 共聚焦显微镜系统，已具备完善的光学系统，模块化的仪器设计，灵活的软件和高配置的计算机 硬件，从而使共聚焦显微镜系统的功能不断升级，应用的领域不断扩展。随着生命科学研究的不 断深入及荧光探针技术的迅速发展，共聚焦显微镜将推动生命科学研究的迅速发展，同时生命科 学研究的进展也将使激光显微镜技术不断改进和完善。 激光共聚焦显微镜是现今最为先进的光学显微镜，其主要优点为：以激光为光源，在相应的 荧光探针标记后，对样本进行逐点扫描，逐层获得二维光学横断面图像，具有“细胞CT”的功能， 并可通过计算机三维重建软件支持，获得真三维图 并可通过计算机三维重建软件支持，获得真三维图1 ,并可以任意角度旋转，观察细胞，组织立 体形态和空间关系；可以对活细胞和组织进行无损伤的观察，动态测量细胞内的Ca离子浓度和 pH值等活细胞生理信息；可对细胞膜的流动性，细胞间通讯，细胞融合，细胞骨架弹性测量等， 可用作“光刀子”完成细胞内“外科手术”。这一技术使得对活细胞和组织进行原位，动态，定量的观 察和测量的梦想成为现实。 第一章 光学显微镜显微镜的基本原理我们大家知道，“工欲善其事，必先利其器”光学显微镜不仅是发现细胞的必要手段，也是生命科学研究基本技术条件。 第一节普通显微镜的基本结构和原理 普通显微镜利用光线照明，标本中的各点以其光吸收（即光的振幅发生变化）的不同而在明亮的背景 中成像。它是由光学系统；机械系统；光源组成。 中成像。 它是由光学系统；机械系统；光源组成。 （—）光学系统 ?目镜 它是插在目镜筒顶部的镜头，由一组透镜组成，可以使物镜成倍地分辨、放大物像，例如 10X. 15X等。按照所能看到的视场大小，目镜可分为视场较小的普通目镜，和视场较大的大视场目 镜（或称广角目镜）两类。较高档显微镜的目镜上还装有视度调节机构，操作者可以方便快捷地对左右 眼分别进行视度调整；此外，在这些目镜上可以加装测量分划板，测量分划板的象总能清晰地调焦在 标本的焦面上；并且，为了防止目镜被取走以及减少运输中被损坏的可能性，这些目镜可以被锁定。 .物镜 它安装在转换器的孔上，也是由一组透镜组成的，能够把物体清晰地放大。物镜上刻有放 大倍数，主要有10X. 20X、40X、60X 100X等。高倍物镜中多采用浸液物镜，即在物镜的下表面 和标本片的上表面之间填充折射率为1.4左右的液体（如杉木油），它能显著的提高显微观察的分辨 率。 物镜的主要参数: 放大率 放大率就是放大倍数，是指被检验物体经物镜放大再经目镜放大后，人眼所看到的最终图象的大小对 原物体大小的比值。是物镜和目镜放大倍数的乘积。放大率也是显微镜的重要参数，但也不能盲目相 信放大率越高越好，在选择时应首先考虑物镜的数值孔径。 数值孔径: 数值孔径简写NA ,数值孔径是物镜和聚光镜的主要技术参数，是判断两者（尤其对物镜而言）性能 高低的重要标志。其数值的大小，分别标科在物镜和聚光镜的外壳上。数值孔径（NA ）是物镜前透 镜与被检物体之间介质的折射率（h ）和孔径角（u ）半数的正玄之乘积。用公式表示如下:NA=hsinu/2 孔径角又称“镜口角”，是物镜光轴上的物体点与物镜前透镜的有效直径所形成的角度。孔径角越大， 进入物镜的光通亮就越大，它与物镜的有效直径成正比，与焦点的距离成反比。显微镜观察时，若想 增大NA值，孔径角是无法增大的，唯一的办法是增大介质的折射率h值。基于这一原理