电镜技术-第8次课.pptVIP

蛋白质样品一定要放到覆膜的载网上去观察。 由于样品很薄，支持膜就不能太厚。塑料膜(火 棉胶和Formvar膜)做的薄，在电镜下易破裂，做 厚了会出现一些无规则的结构。所以都采用低噪 声的碳膜或微筛碳膜。这两种膜机械度较高，耐 电子轰击，有较好的化学稳定性，而且容易被电 子穿透。 常用碳膜是50~1OO?的碳膜，有时也用微筛 碳膜，在Formvar微筛膜上喷一层40~5O? 碳膜， 可制成微筛碳膜，其较结实。 考虑到碳膜的亲水性较差，可以用高压放电 方法来增加碳膜的亲水性。 2）对支持膜的选择 制样时，一般是用滴样法将蛋白质溶液滴在支持膜上，要求蛋白质分子在支持膜上分散度好，要防止溶液干燥时而引起分子聚集，同时要防止蛋白质分子变形和变性。所以要求蛋白质溶液应具有适当的浓度、盐离子浓度和pH值。蛋白质溶液浓度以5μg/ml~lOμg/ml为宜，太低在电镜寻找样品较难;太高，蛋白质分子容易聚集，经染色后不容易看清单个分子的形态结构。盐离子浓度一般不要超过2mmol/L，用挥发性盐类更好，可以避免在载网上形成结晶干扰电镜观察。pH值要避开蛋白质等电点，以使蛋白质完全溶解，防止在等电点附近发生沉淀。同时要选择合适的制样温度和条件，防止蛋白质分子变形和变性。 3）对蛋白质样品的要求 (1)电镜要调到较佳的分辨状态:电镜的加速电压，激 磁电流不稳定度要小。利用“冷井”和其它方法冷 却样品室，以减少样品辐射损伤，防镜筒及样品 污染，有利于提高分辨率。为了减少样品的辐射 损伤，采用“低曝光”技术，如此时图像不清楚， 可装上“图像增强器”使图像清楚。对样品中所需 部位附近结构调焦，再把所需部位移到荧光屏中 心位置拍照的操作，也可以减少图像中的样品辐 射损伤。 4）电镜观察时注意事项 (2)图像解释要慎重:球蛋白、纤维状蛋白分子都 不是真正对称的，而是由不同的亚基组成的， 有二个以上的对称轴，而且制样中分子在支持 膜上的取向又是任意的，同一种分子可以得到 几种形态的电镜照片，所以解释图像要慎重， 要结合物理学、生物化学、X射线技术等才能 最后断定分子的构型。 (3)运用图像处理技术:由于制样和电镜观察中存 在的缺陷，便蛋白质分子的图像有失真，可以 运用图像处理技术进行改善。 用于蛋白质分子负染的染色剂，目前广泛应用的有磷钨酸、磷钨酸钠、甲酸铀、醋酸铀、草酸铀以及硅钨酸钠等。其中磷钨酸和磷钨酸钠最常用，甲酸铀及醋酸铀通常在低于蛋白质等电点时使用，而草酸铀则在高于等电点时应用。 目前用于蛋白质分子的电镜样品制备方法有 负染技术和分子云母复型技术。 1.负染技术 具体制备方法和一般负染技术相仿，有滴样法和喷雾法。不过，要注意所用的负染色剂溶液的pH值不要接近蛋白质的等电点，防止两种溶液混合后使蛋白质沉淀。在其它样品的负染技术中要加人牛血清蛋白等分散剂使样品能在支持膜上均匀分散，而在蛋白质样品中，因本身可增加溶液和支持膜的亲和力，可不加这些分散剂。在磷钨酸染色时，加入微量蔗糖，可以增加染色剂在干燥过程中的粘度及对支持膜的附着力。还可以抑制磷钨酸结晶和形成较大的颗粒结构。 Unwin和Henderson（l975)在研究牛过氧化物酶和嗜盐菌紫膜蛋白制样技术中，用葡萄糖包埋方法代替常规的负染技术。他们把这两种蛋白质滴样在碳膜铜网上，然后铜网带着样品在1%的葡萄糖溶液中浸泡1至几分钟，负染，干燥，镜检。方法中葡萄糖分子代替蛋白质样品中的水介质，蔗糖分子物理和化学性质和水相同，在样品干燥时，葡萄糖分子不易挥发，对蛋白质分子起着支持作用，从而减轻了蛋白质分子在干燥过程中的损伤。加上图像处理技术，Unwin和Henderson得到了5~7?的分辨率。 分子云母复型技术的具体方法是先把适当厚度的云母片划成4cm2左右的小块，剥成两半，新鲜分开的面朝上，放在垫有干净滤纸的培养皿中。将拟观察的蛋白质溶于易挥发的缓冲液中，通常用醋酸铵或碳酸铵溶液。调节溶液浓度、pH值和离子强度，使蛋白质分子的溶液中达到最佳分散状态。用喷雾法把2m1左右的蛋白质溶液喷到新分开的云母片上。将有样品的云母片迅速放入真空喷镀仪中，用铂或铱合金进行投影，厚度适中。投影完后取出云母片，在其上滴一滴1%火棉胶醋酸异戊醋溶液。转动云母片，使火棉胶溶液均匀分布在整个表面上，用滤纸吸去多余的火棉胶溶液。待火棉胶溶液干燥后，用刀片将膜划成小块，用镊子夹着云母片，倾斜一定角度，徐徐放入蒸馏水中，使膜剥离。用载网捞起膜，干燥，镜检。 2.分子云母复型技术 分子云母