进出口食品中苏丹I、苏丹II、苏丹III、苏丹IV的检测方法 液相色谱和液相色谱—质谱质谱法 编制说明.docVIP

《进出口食品中苏丹I、苏丹II、苏丹III、苏丹IV的检测方法 液相色谱和液相色谱—质谱/质谱法》 编制说明 一、任务来源及意义. 1、任务来源 本检验方法标准的修订工作，是按照国家认证认可监督管理委员会下达的任务而进行的，项目编号为2009B757r，项目名称为《进出口食品中苏丹I、苏丹II、苏丹III、苏丹IV的检测方法》，适用范围为辣椒、调味品、谷物加工类、肉制品及糖果中苏丹I、苏丹II、苏丹III、苏丹IV的检测和确证。由河北出入境检验检疫局负责修订工作。 2．制订标准的意义 苏丹红是一种偶氮化合物类合成色素，包括苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ和苏丹红Ⅳ，四种化合物的信息见表1。它们是一类工业合成染料，但由于其成本低廉，着色力强，着色鲜艳稳定，被一些食品工业的不法厂家使用。苏丹红通过食品进入人体后，会大量消耗体内解毒物质，干扰人体正常代谢功能，重者可能致畸、致癌。欧盟、美国、日本等国已禁止苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ和苏丹红Ⅳ作为色素在食品中进行添加，我国也明文禁止。 表1 苏丹Ⅰ、苏丹Ⅱ、苏丹Ⅲ和苏丹Ⅳ四种化合物信息 化合物名称 分子式 分子量 CAS号 苏丹Ⅰ（Sudan Ⅰ） C16H12N2O 248.3 842-07-9 苏丹Ⅱ（Sudan Ⅱ） C18H16N2O 276.3 3118-97-6 苏丹Ⅲ（Sudan Ⅲ） C22H16N4O 352.4 85-86-9 苏丹Ⅳ（Sudan Ⅳ） C24H20N4O 380.5 85-83-6 进出口食品中苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的检测方法（SN/T 1590-2005），已经于2005年发布实施，实施5年来，检测了大量样品，为该类项目的把关服务做出了较大的贡献，但标准制定时，只考虑了辣椒及相关制品的检测，方法的检测对象涉及较少，氧化铝柱净化效果不太理想，尤其对于基质比较复杂的辣椒粉状样品，假阳性结果较多，难以满足实际检测工作的需求；且检测低限国内外均有变化，在标准复审时，专家提出需要修订。本方法参考文献，结合大量实验，确立了多种基质中的苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的检测方法，采用乙酸乙酯提取，凝胶色谱净化，最后用HPLC或LC-MS/MS测定，检测低限可以达到0.01 mg/kg，且能够对阳性样品进行LC-MS/MS确证。 二、主要实验技术认证 1、提取液的选择 苏丹红染料为脂溶性化合物，在选择提取溶剂时，我们对不同基质样品选择乙酸乙酯、正己烷、乙腈为待选提取剂做添加回收率实验，结果发现，对于加工禽肉类食品，乙腈作提取剂回收率较低，用正己烷、乙酸乙酯作提取剂会提取出过多油类等杂质，即使用凝胶色谱净化也不能净化干净，所以实验对这类基质采用乙腈-乙酸乙酯（1+1）作提取剂。对辣椒粉、辣椒酱、裹衣花生、糖果等基质采用乙酸乙酯提取，回收率满足要求，操作安全方便。 2、净化条件的选择 SN/T 1590-2005中使用中性氧化铝层析柱固相萃取净化方法，但由于在制作氧化铝小柱的过程中，氧化铝的活性难以控制，导致回收率不稳定。凝胶渗透色谱能有效去除色素、油脂、蛋白等大分子杂质，所以对辣椒、裹衣花生、加工禽肉类样品采用凝胶色谱净化。在凝胶色谱条件的选择上，采用分段接受的方法确定了净化条件，苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四种染料11.5min开始从GPC色谱柱中淋洗出来，17.5min可完全被洗脱，所以我们设定GPC的程序为0-11.5min弃去林洗液，11.5-17.5min收集林洗液。这样就可以除去样品中的大部分杂质，尽管仍有部分干扰物存在但不影响组分的测定。 3、仪器测定条件的选择 3.1 液相色谱条件的建立 使用Agilent Eclipse XDB-C18(150×4.6 mm, 5 μm)液相色谱柱对苏丹Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ进行分析，采用乙腈+水作为流动相，用95+5和90+10两种不同比例进行分离，发现以90+10比例的流动相可以使4种苏丹红染料达到很好的分离，且不受杂质干扰。 经紫外分光光度计波长扫描，苏丹Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的最大吸收波长分别为480 nm、495 nm、505 nm和515 nm，通过液相色谱实验发现在500 nm检测波长下，这四种物质均有较大响应，在实际检测工作中，可以同时用二级管阵列的检测器在400~600 nm范围内全扫描，对可疑的阳性结果进行初步的定性分析，进一步确证可以使用LC-MS/MS进行。 3.2 液相色谱-质谱/质谱条件的建立 3.2.1 本实验首先比较了ACQUITY HPLC BEH C18 (1.7μm, 100 mm × 2.1mm)和Phenomenex Kinetex C18 (2.6 μm, 100 mm ×2.1 mm)柱对这4种染料的分离效果和色谱峰形。结果发现ACQUITY HPLC BEH C18柱能够保证这 流动