分子生物学研究法核酸技术应用.pptVIP

第五章 分子生物学研究法 七. Western 印迹杂交 图: SBD蛋白的Western斑点杂交结果 第五章 分子生物学研究法 四. 基因扩增 图: pGEM-T 质粒的结构图 第五章 分子生物学研究法 四. 基因扩增 pBluescript II KS + 3.0 Kb ampicillin pUC ori Fl (+) ori EcoR V 图: 质粒pBluescript II KS +的 结构图 MCS 第五章 分子生物学研究法 四. 基因扩增 退火温度一般控制在比引物Tm (melting temperature) 值约低3~5℃。 引物（≤20 bp）的Tm值可按下式计算: Tm = 4(G+C) +2(A+T) 式中: A、T、C、G为4种碱基的数量。 * 合成cDNA的一般原理 第五章 分子生物学研究法 五. 核苷酸序列分析 第五章 分子生物学研究法 五. 核苷酸序列分析 5′ 3′ 5′ 5′ 3′ 3′ ddNTP 掺入到DNA合成反应后导致反应终止 正常的DNA合成反应 第五章 分子生物学研究法 五. 核苷酸序列分析 在测序反应体系中加入： - 模板DNA (3’ 5’ 的单链) - 特异性引物 （带标记的） - DNA聚合酶 （测序酶） - dATP、dTTP、dGTP、dCTP和一种ddNTP 在合成反应中，当这种2 ’, 3’- 双脱氧ddNTP加到寡核 苷酸链生长末端, 由于ddNTP没有3 ’-OH基团, 寡核苷 酸链不能继续延长。 在同一反应中, 将会合成出不同长度的DNA片段混合物， 这些片段具有相同 的5’-末端和以ddNTP结束的3 ’-末端。 第五章 分子生物学研究法 五. 核苷酸序列分析 将这种混合物加到可以区分长度仅差一个核苷酸的不同 DNA片段的变性凝胶中进行电泳分离, 就可以获得一系列 全部以3’-末端ddNTP为终止残基的DNA片段的电泳图谱。 通过放射自显影的方法检测单链DNA片段的放射性条带, 就可以直接读出DNA的核苷酸顺序。 第五章 分子生物学研究法 五. 核苷酸序列分析 双脱氧链终止法测序的基本原理和过程 凝胶电泳方向 3’ AGTTGCTA 5’ 测序胶的判读 * 放射性标记 (测序酶) 第五章 分子生物学研究法 五. 核苷酸序列分析 2. Maxam-Gilbert DNA化学降解法 1） 原理: 用化学试剂处理末端带有放射性标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割，由此在同一反应中产生具有共同起点(放射性标记末端)到发生化学切割位点的一组长度不同的DNA片段。反应混合物经凝胶电泳分离和放射自显影之后, 便可根据X光片底板上所显现的相应谱带, 读出DNA片段的核苷酸顺序。 第五章 分子生物学研究法 五. 核苷酸序列分析 2） 方法 （1）DNA样品制备 首先要对待测定的单链DNA片段的5 ’端作末端标记 。 （2）碱基切割常用的化学试剂: 硫酸二甲酯 - 在酸性条件下, 对G特异性切割 - 在中性条件下, 它作用于 G+A。 肼 又称联氨 (NH2?NH2)